李衛(wèi)平－identificationofnovelgenesinvolvedinlong-chainn

1、Identification of Novel Genes Involved in Long-Chain n-Alkane Degradation by Acinetobacter sp. Strain DSM 17874,APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY

2、 May 2007,長(zhǎng)鏈烷烴, 主鏈長(zhǎng)度大于20個(gè)碳原子，是在原油的處理，運(yùn)輸?shù)冗^(guò)程中主要的環(huán)境污染物。已經(jīng)鑒定出一些細(xì)菌產(chǎn)生的酶能在有氧條件下降解烷烴，如：細(xì)胞色素P450，單氧化酶，雙氧化酶等等。,在烷烴的降解過(guò)程中最為突出的是Pseudomonas putida GPo1 (ATCC2934）中的Alk 系統(tǒng)。該系統(tǒng)能將烷烴經(jīng)β-氧化途徑降解為相對(duì)應(yīng)的醇、醛、羧酸和乙酰輔酶A。多數(shù)已知的降解烷烴的系統(tǒng)主要以降

3、解短鏈烷烴為主。僅一少部分已知的酶與降解長(zhǎng)鏈烷烴相關(guān)。不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter）的細(xì)菌, 能利用主鏈長(zhǎng)度從10到44個(gè)碳原子的烷烴。其中A.sp. strain DSM 17874 能以C10 到C40 的長(zhǎng)鏈烷烴為唯一碳原生長(zhǎng)。,從Acinetobacter中鑒定了兩個(gè)與alkB旁系同源的基因，alkMa 和alkMb, 這兩個(gè)基因均表現(xiàn)為涉及降解主鏈碳原子數(shù)為20的長(zhǎng)鏈烷烴。almA,與降解32碳甚至更長(zhǎng)的長(zhǎng)鏈

4、烷烴相關(guān)。,實(shí)驗(yàn)中所用到的菌株、質(zhì)粒、啟動(dòng)子,構(gòu)建A.sp.DSM 17874 轉(zhuǎn)座突變文庫(kù),pLOFKm質(zhì)粒：帶有min-Tn10 轉(zhuǎn)位子、卡那霉素抗性標(biāo)記, 結(jié)合載體的起始區(qū)oriT，Tn10 轉(zhuǎn)位子帶有IPTG誘導(dǎo)的啟動(dòng)子。該質(zhì)粒在A.sp.DSM 17874 中不能復(fù)制，主要用于構(gòu)建轉(zhuǎn)座突變文庫(kù)。將帶有pLOFKm質(zhì)粒的Escherichia coli S17-1 (pir)/pLOFKm和A.sp.DSM 17874 在抗性

5、選擇壓力下共同培養(yǎng)并用IPTG誘導(dǎo)轉(zhuǎn)座酶的產(chǎn)生，使pLOFKm質(zhì)粒轉(zhuǎn)入A.sp.DSM 17874 中。構(gòu)建的A.sp. DSM 17874 轉(zhuǎn)座突變文庫(kù)包含有近 6,800種 A.sp. DSM 17874 轉(zhuǎn)座突變子。,高通量篩選 A.sp. DSM 17874 轉(zhuǎn)座突變文庫(kù)中不能降解長(zhǎng)鏈烷烴的突變子,在各突變株中加入C32 烷烴，以碘硝基四唑紫 (INT)偵測(cè)各突變株的生長(zhǎng)情況（ INT的減少與細(xì)胞呼吸強(qiáng)度成正比）。篩選突變株中

6、不能利用 C32 烷烴的突變子。為了進(jìn)一步確認(rèn)篩選的結(jié)果，當(dāng)將篩選到的突變子加入到以醋酸鈉或C16 烷烴為唯一碳原的培養(yǎng)基中，各突變子均表現(xiàn)為野生型水平的生長(zhǎng)速率。經(jīng)篩選得到34個(gè)突變子，并鑒定了16個(gè)假定與降解長(zhǎng)鏈烷烴相關(guān)的基因。,almA基因在其它能降解長(zhǎng)鏈烷烴的Acinetobacter屬的菌中的定位,根據(jù)在A.sp. DSM 17874突變菌基因組中與轉(zhuǎn)座子相接的區(qū)域，以almA1和almA2為引物進(jìn)行反向PCR 擴(kuò)增

7、得到Acinetobacter 屬中A.sp. strain M-1和A.sp. strain RAG-1的almA 同源基因。而Acinetobacter baylyi ADP1 ACIAD3192 的基因序列直接從GenBank中獲得。,A.sp DSM 17874 almA 編碼區(qū)與A. baylyi ADP1的 ACIAD3192 表現(xiàn)出74.8% 的序列同源性。而在基因產(chǎn)物AlmA和 ACIAD3192中，同源性為 76.

8、7%。在A.sp. strain DSM 17874 和A.sp. strain RAG-1 中的almA 和 orf1 核算序列完全相同。A.sp. strain DSM 17874 和 A.sp. strain M-1 在核算序列上almA 有85.7% 的同源性，orf1 則有75.5% 。,almA 在Acinetobacter 屬的不同菌中的區(qū)域,構(gòu)建A.sp.DSM 17874 的almA 和 orf1 的缺失突變菌株M

9、AV1 和 BKO2,構(gòu)建自殺性質(zhì)粒 pLAL50和pBKO2以A.sp. DSM 17874的DNA為模版，almA3和almA4為引物擴(kuò)增almA ；orf1:1和orf1:2 為引物擴(kuò)增orf1，將almA擴(kuò)增產(chǎn)物酶切，取約3kb的片斷連接到pSOK804上；將orf1擴(kuò)增產(chǎn)物酶切，將酶切的約3kb的片斷連接到pSOK201上。自殺性質(zhì)粒 pLAL50和pBKO2先以熱轉(zhuǎn)型法轉(zhuǎn)入E. coli S17-1 (pir)中，隨

10、后通過(guò)菌體間的接合作用轉(zhuǎn)入A.sp DSM 17874 中。以Southern印記法檢測(cè)almA 和 orf1 被消除的情況。,almA 基因在降解長(zhǎng)鏈烷烴中的效應(yīng),A.sp. DSM 17874 (野生型; ○) A.sp. strain MAV1 (almA消除突變; ▽),C20,C24,C36,C32,,orf1基因的效應(yīng),在突變株BKO2中研究orf1 是否在長(zhǎng)鏈烷烴代謝中起作用的過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)在以C20、C24、C32、和C

11、36 為唯一碳原的條件下生長(zhǎng)情況與野生型相似。這一結(jié)果表明，orf1 與長(zhǎng)鏈烷烴的代謝并沒(méi)有多大關(guān)系。,構(gòu)建 pALMA1 和 pACIAD1 質(zhì)粒，用作回復(fù)突變的研究,以A.sp. DSM 17874的DNA為模版，almA5和almA6為引物擴(kuò)增almA ，將almA擴(kuò)增產(chǎn)物酶切并連接到pDLM02.1載體上，構(gòu)建pALMA1質(zhì)粒。以A. baylyi ADP1 的ACIAD3192 為模版，ACIAD1和ACIAD2 為引

12、物擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物酶切并連接到 pDLM02.1載體上，構(gòu)建pACIAD1質(zhì)粒。,almA 回復(fù)突變的活力測(cè)定,A.sp. strain DSM 17874/pDLM02.1 (○) A.sp. strain MAV1/pDLM02.1 (□),A.sp. strain MAV1/pALMA1 (▽) A.sp. strain MAV1/pACIAD1 (△),C32,C36,That's all