甲醛誘導雌性大鼠卵巢及子宮毒性研究.pdf

1、甲醛(formaldehyde，F(xiàn)A)，又名蟻醛，分子式為CH3CHO，含有一不飽和羰基，具有強氧化性，化學性質非?；顫?。甲醛廣泛地存在人們的衣食住行中，如室內裝修材料、印刷油墨、紡織纖維、化妝品、殺蟲劑、清潔劑、消毒劑、防腐劑及各種燃料的燃燒中均不同程度地含有甲醛。特別是近20多年來，隨著我國大規(guī)模開發(fā)建筑裝飾、房屋市場，使得人們接觸甲醛的機會比以往大大增加。據(jù)報道，在室內裝修材料內含有的脲醛樹脂可緩慢釋放低濃度甲醛幾年甚至幾十年，可

2、對人體的健康造成潛在的遠期危害。
　　 體外實驗表明，甲醛是一種遺傳毒性致癌物，可誘導外周血淋巴細胞、人白血病細胞(HL-60)、肺巨噬細胞、睪丸細胞等細胞發(fā)生DNA雙鏈斷裂損傷(DSB)，而且隨著甲醛濃度的增加，細胞主要呈現(xiàn)出DNA-DNA、DNA-蛋白質(DPC)的交聯(lián)效應。流行病學研究亦證實，長期低濃度甲醛接觸可導致眼和呼吸道炎癥、支氣管哮喘、神經行為異常及鼻咽癌、肺癌等疾病發(fā)生風險增加。對雌性個體，甲醛還可致不孕(Inf

3、ertility)、死胎(Stillbirth)及胎兒畸形(Fetal malformation)等生殖毒性。但目前，甲醛誘導雌性動物生殖毒性的生物學機制仍未完全清楚，特別是在低劑量接觸條件下，從細胞分子水平上闡明甲醛的毒性機制顯得尤為必要。卵巢與子宮是雌性動物發(fā)揮生殖功能的重要器官，通過卵巢組織中卵原細胞的有絲分裂及減數(shù)分裂，從而形成成熟的卵母細胞(卵子)，并經輸卵管進入子宮等待受精，如果雌性個體在性成熟期受到甲醛的毒性作用，那么卵母

4、細胞的發(fā)育、成熟及受精均會受到影響，有可能會出現(xiàn)流產(abortion)、死胎等難以預測的嚴重后果。
　　 因此，我們以雌性SD大鼠為實驗對象，分別進行低、中、高不同濃度甲醛染毒處理，收集大鼠的血清、卵巢及子宮組織，分別從卵巢儲備功能、卵巢組織細胞形態(tài)學、組織中細胞凋亡相關基因mRNA及蛋白質表達等方面闡述了甲醛對雌性大鼠卵巢及子宮產生損傷的細胞及分子毒理學特征，為甲醛雌性生殖毒性機制的闡明提供參考依據(jù)。
　　 第一部分

5、、甲醛對雌性大鼠卵巢功能及組織結構的毒性研究
　　 (一)甲醛對雌性SD大鼠卵巢儲備功能的影響
　　 目的：探討甲醛對雌性SD大鼠卵巢儲備功能的毒性作用。
　　 方法：將40只SD雌性大鼠隨機分為正常對照組和3個不同濃度(0.2、2.0、20.0 mg/kg)的甲醛染毒組。腹腔注射甲醛染毒，每天1次，連續(xù)染毒14天，14天后采用股動脈放血法處死受試動物，并收集血清，用化學發(fā)光法測定血清雌二醇(E2)濃度；用酶聯(lián)免

6、疫方法測定抑制素B(inhibin B)濃度；用放射免疫方法測定卵泡刺激素(FSH)和黃體生成激素(LH)的濃度。同時解剖摘取卵巢稱重，計算臟器系數(shù)。
　　 結果：甲醛染毒組與對照組比較，各染毒劑量組大鼠血清E2、Inhibin B水平明顯降低(P<0.05)，F(xiàn)SH水平顯著升高(P<0.05)；高、中劑量組大鼠血清LH水平均有所升高，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。各染毒劑量組卵巢臟器系數(shù)顯著降低(P<0.05)。

7、　　 結論：甲醛對SD雌性大鼠卵巢儲備功能有一定損害作用。
　　 (二)甲醛對雌性SD大鼠卵巢組織和細胞顯微及超微結構的影響
　　 目的：研究甲醛對雌性大鼠卵巢組織結構、卵母細胞及顆粒細胞的顯微及超微結構的影響。
　　 方法：將40只SD雌性大鼠隨機分為正常對照組和3個不同濃度甲醛染毒組，腹腔注射甲醛，劑量分別為20.0、2.0和0.2 mg/kg，每天1次，連續(xù)14天，14天后處死所有大鼠取卵巢組織，應用HE

8、染色光鏡觀察雌性大鼠卵巢組織病理形態(tài)變化，應用電鏡技術觀察雌性大鼠卵母細胞及顆粒細胞超微結構的變化，應用原位末端轉移酶標記法(TUNEL)檢測卵母細胞及顆粒細胞凋亡的情況。
　　 結果：甲醛可引起雌性大鼠卵巢組織發(fā)生病理學改變，如卵巢皮質輕度萎縮、結構紊亂，間質小血管擴張充血及纖維組織增生等病理改變，其病理變化程度與甲醛呈劑量依賴性；電鏡檢查發(fā)現(xiàn)甲醛可破壞卵母細胞、顆粒細胞超微結構，出現(xiàn)細胞核模糊、不規(guī)則，粗面內質網及線粒體數(shù)量

9、明顯減少，線粒體腫脹及嵴模糊，以及核膜皺縮、染色質邊集、核仁變小或消失等細胞早期凋亡特征。其細胞超微結構變化的程度與甲醛亦呈劑量依賴性；TUNEL染色觀察發(fā)現(xiàn)甲醛染毒組大鼠卵母細胞和顆粒細胞的凋亡率均高于對照組，且中、高劑量組和對照組比較差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
　　 結論：甲醛對雌性大鼠的卵巢組織結構、卵母細胞及顆粒細胞的超微結構造成不良影響，促使卵母細胞及顆粒細胞呈凋亡發(fā)展趨勢。
　　 第二部分、甲醛誘導

10、雌性大鼠卵巢組織Fas凋亡途徑基因及蛋白表達變化
　　 目的：觀察甲醛對雌性大鼠卵巢組織Fas，半胱氨酸蛋白酶caspase-8和caspase-3表達的影響，探討甲醛對雌性大鼠卵巢毒性的分子機制。
　　 方法：將40只雌性SD大鼠隨機分為正常對照組和3個不同濃度甲醛處理組，腹腔注射甲醛，劑量分別為20.0、2.0和0.2 mg/kg，每天1次，連續(xù)14天后處死所有大鼠后取卵巢組織，用逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)檢

11、測Fas和半胱氨酸蛋白酶(caspase-8)mRNA表達，免疫印跡法(Western-Blot)檢測Fas蛋白表達，分光光度法(UV-visible spectrophotometry)檢測caspase-8和caspase-3的活性。
　　 結果：甲醛染毒組卵巢組織Fas與caspase-8 mRNA表達以及caspase-8和caspase-3活性明顯高于對照組，且隨劑量的增加而增加(P<0.05)。
　　 結論：

12、Fas基因表達與caspase活性增強可能是甲醛誘導雌性動物卵巢毒性的重要機制。
　　 第三部分、甲醛對雌性SD大鼠卵巢及子宮組織線粒體依賴性細胞凋亡相關基因表達的干擾效應
　　 目的：觀察甲醛對雌性大鼠卵巢及子宮組織線粒體依賴性細胞凋亡途徑相關基因VDAC1、ANT1、hOGG1 mRNA表達水平的影響。
　　 方法：將20只雌性SD大鼠隨機分為正常對照組和3個不同濃度甲醛處理組，腹腔注射甲醛，劑量分別為40.

13、0、4.0和0.4 mg/kg，每天1次，連續(xù)5天后處死所有大鼠，取卵巢組織及子宮組織，應用逆轉錄熒光定量PCR法(RT-qPCR)檢測了電壓依賴性陰離子通道(VDAC1)、腺苷酸轉運蛋白(ANT1)、8-羥基鳥嘌呤糖苷酶(hOGG1)基因的mRNA表達水平變化。
　　 結果：甲醛染毒處理后，在卵巢和子宮組織，VDAC1、ANT1基因mRNA表達水平明顯增加，其中子宮組織相比而言增加較為明顯，在低、中、高劑量組織均明顯增加(P<

14、0.05)。而對于hOGG1而言，卵巢和子宮組織表達相類似，在低劑量甲醛組，hOGG1 mRNA表達變化不明顯，在中、高劑量甲醛處理組，hOGG1 mRNA表達明顯降低(P<0.05)。
　　 結論：甲醛可誘導雌性大鼠卵巢及子宮組織VDAC1、ANT1mRNA表達水平異常增加以及氧化損傷修復基因hOGG1 mRNA表達明顯降低，可能與線粒體損傷誘發(fā)的細胞凋亡程序激活有關。
　　 綜上三個部分所述，在不同劑量甲醛染毒條件下

15、，甲醛可誘導雌性大鼠卵巢儲備功能產生損害，主要表現(xiàn)為血清雌二醇(E2)、抑制素B(inhibin B)濃度明顯降低，而卵泡刺激素(FSH)水平明顯升高。同時甲醛可對大鼠卵巢組織、卵母細胞及顆粒細胞產生病理性損害，引起卵巢皮質萎縮、結構紊亂，纖維組織增生等病理改變以及卵母細胞、顆粒細胞的超微結構呈現(xiàn)細胞核膜皺縮、線粒體腫脹、核仁變小或消失等早期細胞凋亡特征。在分子水平上我們亦發(fā)現(xiàn)甲醛可誘導大鼠卵巢或子宮組織Fas凋亡途徑及線粒體依賴性細胞