全國流感監(jiān)測技術指南

1、全國流感監(jiān)測技術指南要點解析,山東省疾病預防控制中心病毒病所電話：0531-82679686/82679461E-mail:crbfzs@vip.163.com,,所有講課PPT都將放在我們公共郵箱里： 郵箱名：crbfzs@163.com 密碼：crbfzs,內容,監(jiān)測目的流感樣病例監(jiān)測流感樣病例暴發(fā)疫情監(jiān)測,一、監(jiān)測目的,監(jiān)測流感活動水平和流行動態(tài)；及時發(fā)現(xiàn)流感病毒變異并做出預警

2、；為全球及我國流感疫苗毒株的預測和推薦提供依據。,二、流感樣病例監(jiān)測,監(jiān)測對象和時間,監(jiān)測對象：流感樣病例，即發(fā)熱（體溫≥38℃），伴咳嗽或咽痛之一者。監(jiān)測時間 ：所有國家級流感樣病例監(jiān)測哨點醫(yī)院和流感監(jiān)測網絡實驗室均全年開展流感樣病例監(jiān)測。,監(jiān)測診室的設置,城市綜合醫(yī)院在內科門診、內科急診、發(fā)熱門診和（或）兒內科門診、兒內科急診開展流感樣病例的監(jiān)測；內科門診開展流感樣病例監(jiān)測的診室應包括所有內科診室和感染性疾病科。注：包括監(jiān)測

3、哨點醫(yī)院設置的發(fā)熱門診和感染性疾病科。城市兒童醫(yī)院在兒內科門診、兒內科急診和（或）發(fā)熱門診開展流感樣病例的監(jiān)測。不能僅將發(fā)熱門診設為監(jiān)測診室,哨點醫(yī)院監(jiān)測診室的醫(yī)務人員，按照流感樣病例的定義，每天按科室登記各年齡組的流感樣病例數和門急診病例就診總數，由哨點醫(yī)院主管科室每日收集、匯總后，于每周一將本院各監(jiān)測診室上周數據錄入到“中國流感監(jiān)測信息系統(tǒng)”。各市疾控中心每周一15時之前對本轄區(qū)監(jiān)測哨點醫(yī)院報告的數據進行審核，并將數據匯總

4、后傳真至省疾控中心。流感樣病例數和門急診病例就診總數在每個監(jiān)測診室的產生來源必須一致。,流感樣病例的報告,,北方省份每家哨點醫(yī)院在4-9月份每月采集5-15份流感樣病例標本，10月-次年3月每周采集10-15份流感樣病例標本。應避免集中、突擊采樣。采樣對象：發(fā)病3天內的流感樣病例。標本采集種類包括咽拭子、鼻拭子、鼻咽拭子。標本采集后放入含3-4ml采樣液的采樣管中。,流感樣病例標本的采集,標本采集后在保證生物安全條件下在48h

5、內運送至相應的流感監(jiān)測網絡實驗室，保存溫度為4℃以下；如未能48h內送至實驗室的，應置-70℃或以下保存，并應保證采集的標本1周內送到對應的網絡實驗室。標本應避免反復凍融。全國流感監(jiān)測網絡實驗室的工作人員接到標本后，48h內將“流感樣病例標本原始登記送檢表”錄入到“中國流感監(jiān)測信息系統(tǒng)”中。,流感樣病例標本運送,,,生物安全：BSL-2級及以上實驗室具備病毒分離能力的實驗室：利用狀態(tài)良好的MDCK細胞進行病毒分離。MDCK細胞病

6、毒分離陽性再用雞胚進行病毒分離。 不具備病毒分離能力的實驗室：收到標本后1周內利用核酸檢測方法進行流感病毒亞型鑒定。檢測結果在檢測完成后48h內錄入“中國流感監(jiān)測信息系統(tǒng)”。,流感樣病例實驗室檢測,核酸檢測的及時性,,目前多采用雞胚和MDCK細胞進行流感病毒分離。通過雞胚分離的流感毒株與原始標本的抗原性和基因特性可能會有所不同，而通過MDCK細胞所分離的流感病毒與原始標本相似。且MDCK細胞對“O”相毒株的敏感性遠高于

7、雞胚，故MDCK細胞已成為流感病毒分離不可缺少的一種宿主系統(tǒng)。但目前全球主要使用雞胚進行流感疫苗生產，MDCK細胞分離的病毒在很多國家尚未批準用于疫苗生產，因此雞胚分離仍然發(fā)揮著舉足輕重的作用。,,,,,流感樣病例實驗室檢測,標本處理：收到標本后，24小時內進行標本處理和病毒分離，將原始標本分為三份，一份接種MDCK細胞接種，一份雞胚接種，一份-70℃或以下溫度保存待復核；標本集中、收獲和鑒定：培養(yǎng)1次的陰性標本可不再進行盲傳，對血凝

8、滴度小于1:16的毒株，稀釋后進行傳代。,流感樣病例實驗室檢測,各網絡實驗室將分離到的所有符合上送標準的流感毒株，同時上送國家流感中心和省級疾病預防控制中心 。標本采集到送至國家流感中心的時間不超過1個月。 注：上送標準：HA≥1:16,血凝抑制試驗分型，量不低于5.5毫升（國家3毫升，省疾控中心2.5毫升）每個開展病毒分離的網絡實驗室向國家流感中心上送流感毒株數量每年不低于30株，流行季節(jié)每月不少于5株。,,,,

9、,省級參比中心評估方案要求,?。▍^(qū)、市）內2/3的網絡實驗室開展流感病毒分離工作；全?。▍^(qū)、市）連續(xù)2年每家開展流感病毒分離的網絡實驗室每年送國家流感中心的毒株不少于30株；全省（區(qū)、市）連續(xù)2年送國家流感中心的毒株復核一致率在90%以上。,流感樣病例實驗室檢測,毒株保存：液體毒株可在-70℃或以下溫度保存3年，凍干保存毒株可在4 ℃及以下溫度條件長期保存，各網絡實驗室對分離出病毒株的原始標本應在-70℃及以下溫度保存至少6個月。各網

10、絡實驗室對HA陽性不能區(qū)分型別或亞型的毒株和陽性標本務必在48小時內送至國家流感中心。,,,三、流感樣病例暴發(fā)疫情監(jiān)測,暴發(fā)疫情定義,指一個地區(qū)或單位短時間出現(xiàn)異常增多的流感樣病例。報告標準：（1）1周內，在同一學校、幼兒園或其他集體單位發(fā)生30例及以上流感樣病例；或發(fā)生5例及以上因流感樣癥狀住院病例（不包括門診留觀病例）；或發(fā)生2例及以上有流行病學關聯(lián)的死亡病例。（2）在某一社區(qū)內（如同一村莊或街道辦事處）一周內出現(xiàn)流感樣病

11、例異常增多?？筛鶕镜匾咔樘攸c及防控工作需要，制定更為敏感的暴發(fā)疫情報告標準。,我省流感監(jiān)測方案（2012版）對流感樣病例聚集疫情和暴發(fā)疫情報告要求：,⒈流感樣病例聚集疫情監(jiān)測⑴學校、托幼機構在同一班級或集體單位同一部門一周內出現(xiàn)流感樣病例5例以上（含5例），或同一宿舍超過3例以上（含3例），應立即報告屬地縣（市、區(qū)）疾病預防控制中心報告。縣（市、區(qū)）疾病預防控制中心接到報告后，應立即趕赴現(xiàn)場進行疫情核實、開展流行病學調查，并采集

12、標本。調查報告應盡快逐級上報給省疾病預防控制中心，采集標本應在24小時內送達流感監(jiān)測網絡實驗室。 ⑵學校、托幼機構在同一年級或集體單位一周內出現(xiàn)流感樣病例10例以上（含10例）、30例以下（不含30例），應立即報告所在地縣（市、區(qū)）疾病預防控制中心。縣（市、區(qū)）疾病預防控制中心接到報告后立即報告市級疾控機構，并及時趕赴現(xiàn)場開展流行病學調查、采集標本。核實疫情后，2小時內進行網絡直報，調查報告及時逐級上報省疾病預防控制中心，同時報告當

13、地衛(wèi)生行政部門和通報教育行政部門。采集標本應在24小時內送達流感監(jiān)測網絡實驗室。在聚集性疫情調查處理的過程中，根據疫情進展情況，及時對首次報告、進程報告和結案報告進行網絡直報。,,⒉流感樣病例暴發(fā)疫情監(jiān)測⑴流感樣病例暴發(fā)是指一個地區(qū)或單位短時間出現(xiàn)異常增多的流感樣病例：1周內，在同一學校、幼兒園或其他集體單位發(fā)生30例及以上流感樣病例；或發(fā)生5例及以上因流感樣癥狀住院病例（不包括門診留觀病例）；在某一社區(qū)內（如同一村莊或街道辦事處）一

14、周內出現(xiàn)流感樣病例異常增多。,各疫情單位發(fā)現(xiàn)流感樣病例聚集性病例或暴發(fā)疫情后，應在2小時內以電話或傳真等方式向屬地縣級疾病預防控制機構（農村學校向當地鄉(xiāng)鎮(zhèn)衛(wèi)生院防保組）報告。縣級疾病預防控制機構或鄉(xiāng)鎮(zhèn)衛(wèi)生院防保組及時核實疫情，如達到報告標準，應在2小時內進行網絡直報。,暴發(fā)疫情的發(fā)現(xiàn)與報告,,（1）首例發(fā)病時間填寫本次暴發(fā)疫情中第一例流感樣病例的發(fā)病時間，末例發(fā)病時間填寫本次暴發(fā)疫情中最后一例流感樣病例的發(fā)病時間。（2）暴發(fā)疫情事件中

15、的確診病例要與“疾病監(jiān)測信息報告管理系統(tǒng)”中的病例個案進行關聯(lián)，未在“疾病監(jiān)測信息報告管理系統(tǒng)”報告的確診病例要進行補報。（3）承擔檢測工作的網絡實驗室，要在“中國流感監(jiān)測信息系統(tǒng)”中錄入標本的實驗室檢測結果。報告該起疫情的疾病預防控制機構負責將標本信息和“疾病監(jiān)測信息報告管理系統(tǒng)”中病例個案進行關聯(lián)。（4）在暴發(fā)疫情調查處理的進程中，各級疾病預防控制機構要及時對《流感樣病例暴發(fā)疫情報告表》首次報告并進行更新，并做好進程報告和結案報

16、告。,,,,采集發(fā)病3天內流感樣病例的鼻、咽、咽鼻拭子標本，必要時可采集急性期（發(fā)病7天內）和恢復期（發(fā)病2-4周）雙份血清標本。每一起暴發(fā)疫情至少采集10份咽、鼻拭子標本（如果現(xiàn)癥病例在10例以下的，應全部采樣）。不能明確病原的可增加采樣批次和數量。標本運輸：4℃條件下，于24小時內運送至流感監(jiān)測網絡實驗室 。,暴發(fā)疫情標本采集,所有網絡實驗室收到暴發(fā)疫情標本后，24h內利用核酸檢測方法進行流感病毒亞型鑒定，檢測結果在檢測完成后2

17、4h內上報“中國流感監(jiān)測信息系統(tǒng)”。具備流感病毒分離能力的流感監(jiān)測網絡實驗室：對核酸檢測流感病毒陽性的標本進行病毒分離。每起暴發(fā)疫情至少對5份核酸檢測陽性的標本開展病毒分離，如采集標本數或核酸檢測陽性的標本數小于5份，則對全部標本均進行病毒分離。,暴發(fā)疫情標本實驗室檢測,,2011年4月1日至今，山東省共報告8起流感樣病例聚集性疫情和暴發(fā)疫情，其中濟南市報告2起，濟寧市報告6起，共報告流感樣病例病419例，6起發(fā)生在中小學，2起發(fā)生

18、在村莊；經實驗室檢測，3起為B型流感，2起為甲型H3N2流感，2起為腺病毒感染，1起未確定性質。8起疫情共采集標本92份，對其中11份進行了病毒分離，1份H3N2陽性，對73份標本進行了核酸檢測，27份B型陽性，11份H3N2陽性。,,,,,,,,,,,,,,,,,四、流感樣病例標本采集,標本種類臨床標本 鼻拭子、咽拭子、鼻咽吸取物等血清標本 病人的急性期和恢復期雙份血清,流感病毒標本采集,臨床樣本收集的

19、注意事項要做好自我保護，操作要細心，嚴防標本間交叉污染采集禽流感疑似病人的標本，最好采集下呼吸道吸取物采集標本要有一定力度標本采集后應迅速至于冰上或者4 ℃以下保存，因為流感病毒對熱很敏感,,臨床標本處理,鼻、咽拭子：為帶有聚丙烯纖維的拭子標本，應先將帶有聚丙烯纖維的拭子在管壁反復擠壓后取出。鼻咽抽取液：用干凈滅菌的毛細吸管在無菌條件下反復吹打收集的溶液，以便打碎粘液，置4℃待其自然沉淀5～10min，取上清。上清液

20、可直接接種或低溫保存。組織標本的處理：取肺組織標本放至平皿中，用滅菌生理鹽水清洗肺組織2～3遍，研磨成組織懸液，配置成10％～20％的組織懸液，2000rpm離心10min，加入抗菌素，取上清直接接種。如原始采樣液中未加入抗菌素，應在標本接種前補加，慶大霉素終濃度為10mg/mL，青/鏈霉素（終濃度:青霉素G 100U/mL,硫酸鏈霉素100μg/mL），混勻后置4℃過夜或作用2h后進行接種。,血清學標本注意事項應采集急性期

21、和恢復期的雙份血清采集空腹血,標本必須放在大小適合的帶螺旋蓋內有橡膠圈的塑料管里，擰緊；將密閉后的標本放入大小適合的塑料袋內密封；每袋裝一份標本；在采樣管上用油性記號筆做好標記用塑料袋密封。同時填寫“流感/人禽流感監(jiān)測病例標本原始登記表”，用另一塑料袋密封；將裝標本的密封袋放入專用運輸箱內，放入冰排，然后以柔軟物質填充，內襯具吸水和緩沖能力的材料。同一患者2份以上的密封標本，可以放在同一個塑料袋內再次做密封。所有容器必須

22、有生物危險標識。,臨床標本的包裝,,五、實驗室檢測,2024/3/18,55,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,樣本采集,,,鼻咽拭子,,,雙份血清,,,快速診斷,,,血凝抑制試驗或中和試驗,,,,,分型鑒定,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,病毒分離,常采用雞胚和MDCK細胞分離方法流感病毒分離：生物安全二級實驗室禽流感病毒分離：生物安全三級實驗室,病毒分離方法,正常細胞,病變細胞,病毒分離注意

23、事項,細胞分離流感病毒 選擇敏感MDCK細胞 細胞70～90％成片 雞胚分離流感病毒 9日齡SPF雞胚 季節(jié)型流感病毒尿囊腔和羊膜腔接種分離病毒 人禽流感病毒尿囊腔分離病毒,流感病毒操作要求生物安全規(guī)程禁止在同一實驗室，同一時間處理接種未知臨床標本和已知標準病毒禁止在同一實驗室，同一時間處理接種采自不同動物的標本 動物標本（如豬、

24、禽等）必須與人的標本分別保存,流感病毒實驗室交叉污染的避免,鑒定方法血清學方法紅細胞凝集及凝集抑制試驗其它方法核酸檢測快速檢測試劑盒,流感病毒鑒定,使用的試劑可靠無誤紅細胞懸液濃度是否合適處理后的血清有無殘余非特異性凝集素選用標準抗血清是否準確讀取HA試驗的結果是否正確4個血凝單位是否準確紅細胞陰性對照待鑒定病毒確保沒有被細菌污染稀釋血清、病毒、紅細胞懸液加入量準確,紅細胞凝集抑制試驗注意事項,RT-PCR