限制性內(nèi)切酶消化

1、DNA 限制性內(nèi)切酶消化,,實驗原理,限制性內(nèi)切酶：識別回文序列，產(chǎn)生粘性或平性末端，具有相同粘性或平性末端的不同DNA片段可連接起來形成重組DNA分子，故DNA限制性內(nèi)切酶是分子生物學實驗中重要的工具酶。影響酶活性的因素有很多，溫度、pH值、離子強度、激活劑或抑制劑等都影響酶的酶切活性,實驗原理,每種酶有其最適的緩沖體系（低鹽、中鹽、高鹽等）單酶切反應雙酶切反應,酶反應體系：,底物DNA 限制性內(nèi)切酶：1-5U/μgDNA

2、 pH TRis-HCl緩沖液 小牛血清白蛋白 NaCl 溫度:37℃ 時間：1-2h,實驗步驟,pBR322 2 μlPstⅠ 2 μlEcoRⅠ 2 μl10×Buffer 2 μlddH2O 12 μl總體積 20 μl,,,封口膜封口,瞬時離心,,37℃ 水浴，2h,,65℃ 加熱滅活終止反應,冰

3、水浴,DNA瓊脂糖凝膠電泳,原理： 瓊脂糖凝膠電泳通過電荷效應和分子篩效應分離不同分子量大小的DNA，相同分子量的DNA分子若構型不同電泳速度亦不同。瓊脂糖凝膠電泳是分離、純化、鑒定DNA片段的典型方法，特點是制備簡單、快捷，靈敏,,溴化乙錠為ＤＮＡ熒光染料，可插入DNA雙螺旋結構的兩個堿基之間，與與核酸結合成熒光復合物，在紫外線254 ～365nm照射下呈桔紅色熒光。電泳時所需DNA樣品量僅0.5～1μg.,線性DNA片段分離