實(shí)驗(yàn)五 dna的限制性內(nèi)切酶酶切反應(yīng)(定稿)

1、實(shí)驗(yàn)五實(shí)驗(yàn)五DNA的限制性內(nèi)切酶酶切反應(yīng)的限制性內(nèi)切酶酶切反應(yīng)DNArestrictionenzymedigestion一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康囊?、?shí)驗(yàn)?zāi)康耐ㄟ^(guò)本實(shí)驗(yàn)掌握DNA的限制性內(nèi)切酶酶切反應(yīng)的基本原理與實(shí)驗(yàn)過(guò)程。二、實(shí)驗(yàn)原理二、實(shí)驗(yàn)原理限制性內(nèi)切酶能特異地結(jié)合于一段被稱為限制性酶識(shí)別序列的DNA序列之內(nèi)或其附近的特異位點(diǎn)上并切割雙鏈DNA。它可分為三類:Ⅰ類和Ⅲ類酶在同一蛋白質(zhì)分子中兼有切割和修飾(甲基化)作用且依賴于ATP的存在。Ⅰ類酶結(jié)

2、合于識(shí)別位點(diǎn)并隨機(jī)的切割識(shí)別位點(diǎn)不遠(yuǎn)處的DNA，而Ⅲ類酶在識(shí)別位點(diǎn)上切割DNA分子然后從底物上解離。Ⅱ類由兩種酶組成:一種為限制性內(nèi)切核酸酶(限制酶)它切割某一特異的核苷酸序列另一種為獨(dú)立的甲基化酶它修飾同一識(shí)別序列。絕大多數(shù)Ⅱ類限制酶識(shí)別長(zhǎng)度為4至6個(gè)核苷酸的回文對(duì)稱特異核苷酸序列(如EcⅠ識(shí)別六個(gè)核苷酸序列:5G↓AATTC3)有少數(shù)酶識(shí)別更長(zhǎng)的序列或簡(jiǎn)并序列。Ⅱ類酶切割位點(diǎn)在識(shí)別序列中有的在對(duì)稱軸處切割產(chǎn)生平末端的DNA片段(如S

3、ma:5CCC↓GGG3)有的切割位點(diǎn)在對(duì)稱軸一側(cè)產(chǎn)生帶有單鏈突出末端的DNA片段稱粘性未端如EcⅠ切割識(shí)別序列后產(chǎn)生兩個(gè)互補(bǔ)的粘性末端。5…G↓AATTC…3→5…GAATTC…3；3…CTTAA↑G…5→3…CTTAAG…5。PvuI的識(shí)別序列5…ＣＧＡＴ↓ＣＧ…3→5…ＣＧＡＴＣＧ…3三、實(shí)驗(yàn)儀器與設(shè)備三、實(shí)驗(yàn)儀器與設(shè)備水平式電泳裝置電泳儀臺(tái)式高速離心機(jī)恒溫水浴鍋微量移液槍微波爐紫外透射儀凝膠成像系統(tǒng)四、實(shí)驗(yàn)材料與試劑四、實(shí)驗(yàn)材料

4、與試劑pUC18質(zhì)粒：2686bp，0.5μgμl，40μl管（日本東洋紡織株式會(huì)社）PvuI酶及其酶切緩沖液：10Uμl，200U管（北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限公司），在pUC18質(zhì)粒上有兩個(gè)酶切位點(diǎn)，分別為酶切第一個(gè)堿基位是276（896bp）、2066（1790bp)10X的酶切反應(yīng)體系（使用時(shí)酶切反應(yīng)體系為1X）乙醇，混勻后置70℃低溫冰箱30分鐘，離心、干燥并重新溶于緩沖液后進(jìn)行第二個(gè)酶切反應(yīng)。4.在酶切圖譜制作過(guò)程中，為了獲得

5、條帶清晰的電泳圖譜，一般DNA用量約為0.51μg。限制性內(nèi)切酶的酶解反應(yīng)最適條件各不相同各種酶有其相應(yīng)的酶切緩沖液和最適反應(yīng)溫度(大多數(shù)為37℃)。對(duì)質(zhì)粒DNA酶切反應(yīng)而言限制性內(nèi)切酶用量可按標(biāo)準(zhǔn)體系1μgDNA加1單位酶消化12小時(shí)。但要完全酶解則必須增加酶的用量一般增加23倍甚至更多反應(yīng)時(shí)間也要適當(dāng)延長(zhǎng)。（DNA限制性內(nèi)切酶酶切圖譜又稱DNA的物理圖譜，它由一系列位置確定的多種限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)組成，以直線或環(huán)狀圖式表示。構(gòu)建D

6、NA限制性內(nèi)切酶圖譜有許多方法。通常結(jié)合使用多種限制性內(nèi)切酶，通過(guò)綜合分析多種酶單切及不同組合的多種酶同時(shí)切所得到的限制性片段大小來(lái)確定各種酶的酶切位點(diǎn)及其相對(duì)位置。酶切圖譜的使用價(jià)值依賴于它的準(zhǔn)確性和精確程度。）5、許多實(shí)驗(yàn)制備的DNA不易于降解，需適當(dāng)增加酶的使用量。反應(yīng)液中加入過(guò)量的酶是不合適的，除考慮成本外，酶液中的微量雜質(zhì)可能干擾隨后的反應(yīng)。6、市場(chǎng)銷售的酶一般濃度很大，為節(jié)約起見(jiàn)，使用時(shí)可事先用酶反應(yīng)緩沖液（1）進(jìn)行稀釋。另