限制性核酸內(nèi)切酶

1、限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶：是識(shí)別DNA的特異序列，并在識(shí)別位點(diǎn)或其周圍切割雙鏈DNA的一類內(nèi)切酶。限制性核酸內(nèi)切酶的分類：限制性核酸內(nèi)切酶的分類：根據(jù)限制酶的結(jié)構(gòu)輔因子的需求切位與作用方式，可將限制酶分為三種類型，分別是第一型（TypeI）、第二型（TypeII）及第三型（TypeIII）。第一型限制酶第一型限制酶同時(shí)具有修飾(modification)及認(rèn)知切割(restriction)的作用；

2、另有認(rèn)知(recognize)DNA上特定堿基序列的能力，通常其切割位(cleavagesite)距離認(rèn)知位(recognitionsite)可達(dá)數(shù)千個(gè)堿基之遠(yuǎn)并不能準(zhǔn)確定位切割位點(diǎn)，所以并不常用。例如：EcoB、EcoK。第二型限制酶第二型限制酶只具有認(rèn)知切割的作用，修飾作用由其他酵素進(jìn)行。所認(rèn)知的位置多為短的回文序列(palindromesequence)；所剪切的堿基序列通常即為所認(rèn)知的序列。是遺傳工程上，實(shí)用性較高的限制酶種類。

3、例如：EcI、HindIII。第三型限制酶第三型限制酶與第一型限制酶類似，同時(shí)具有修飾及認(rèn)知切割的作用?？烧J(rèn)知短的不對(duì)稱序列，切割位與認(rèn)知序列約距2426個(gè)堿基對(duì)，并不能準(zhǔn)確定位切割位點(diǎn)，所以并不常用。例如：EcoPI、HinfIII。限制酶在遺傳學(xué)方面的應(yīng)用：限制酶在遺傳學(xué)方面的應(yīng)用：1、在甚因工程方面利用能產(chǎn)生“粘性末端”的限制酶進(jìn)行DNA的體外重組是較為方便的只要用同一限制酶處理不同來源的DNA由于所產(chǎn)生的水解片段具有相同的粘性末

4、端可以彼此“粘合”再經(jīng)連接酶處理就成為重組DNA分子了.目前基因工程上限制酶主要應(yīng)用于以下兩方面?（1）目的基因與載體的重組細(xì)菌細(xì)胞中的限制酶能水解外源DNA因此必須通過適當(dāng)?shù)妮d體(質(zhì)粒或噬菌體)的幫助才能將外源DNA引人受體細(xì)胞并在其中增殖和表達(dá)。將供體DNA與載體用同樣的限制酶處理使載體帶上各種各樣的外源DNA片斷然后引人受體細(xì)菌細(xì)胞增殖菌細(xì)胞增殖再篩選出所需的菌株便獲得帶有某一目的基因的繁殖系.用這種方法已成功地將酵母菌的咪哇限制

5、性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶NotNotⅠ一、概念：NotⅠ是一種罕見的限制性內(nèi)切酶，它可識(shí)別八個(gè)堿基的核酸序列(5GCGGCCGC3)，在低鹽的情況下它還可識(shí)別(5ACGGCCGT3)。NotⅠ不僅為一普通的限制性內(nèi)切酶，它在生物領(lǐng)域的其他方向也具有重要的應(yīng)用價(jià)值及研究潛力，有關(guān)NotⅠ蛋白性質(zhì)特征及功能機(jī)制等方面的報(bào)道最近日漸增多。二、應(yīng)用：1.NotⅠ識(shí)別位點(diǎn)每65kb的隨機(jī)堿基序列中才出現(xiàn)一次，故可被用于基因組大片段的產(chǎn)生以及D

6、NA甲基化定位圖譜的繪制。2.因?yàn)槠渥R(shí)別位點(diǎn)中富含G∶C序列，故其在真核生物基因組的GpC島上出現(xiàn)頻率較高（GpC島通常位于基因轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域，并且是DNA甲基化的熱點(diǎn)區(qū)域）因此它可在很大程度上影響基因的表達(dá)。NotⅠ對(duì)甲基化相當(dāng)敏感，甲基化其識(shí)別位點(diǎn)的2或6位胞嘧啶上C5的任何一位都會(huì)阻止DNA被切割?；谄涞皖l率性和甲基化敏感性，NotⅠ通?？杀挥糜谠诘貥?biāo)基因組掃描技術(shù)(RestrictionLmarkGenomicScanning，

7、RLGS)中引進(jìn)放射性標(biāo)記物，這一技術(shù)已在腫瘤細(xì)胞中異常甲基化的研究中得到了廣泛應(yīng)用［3］。3.在目前已被公認(rèn)的各種限制性內(nèi)切酶中，NotⅠ是唯一一個(gè)發(fā)現(xiàn)具有金屬結(jié)構(gòu)域的蛋白酶。這一結(jié)構(gòu)域由金屬離子及四面體結(jié)構(gòu)的Cys4模體構(gòu)成的，位于靠近DNA識(shí)別位點(diǎn)的區(qū)域，在維持蛋白的組織結(jié)構(gòu)上起一定作用。這一研究結(jié)果表明NotⅠ有可能是隨機(jī)性核酸內(nèi)切酶(其可識(shí)別更長的目的片段)與限制性核酸內(nèi)切酶的中間進(jìn)化產(chǎn)物。因此，為進(jìn)行NotⅠ蛋白結(jié)構(gòu)、性質(zhì)及

8、機(jī)理的進(jìn)一步研究，其高表達(dá)菌株的構(gòu)建及高純度蛋白的大量獲得顯得極為重要。三、研究現(xiàn)狀：但目前商品化NotⅠ蛋白的價(jià)格依然居高不下，其主要原因在于表達(dá)量低、提純程序繁瑣、得率低等問題的存在，這一原因亦是造成許多其他廣泛應(yīng)用的限制性內(nèi)切酶價(jià)格昂貴的主要因素?，F(xiàn)在NotⅠ純化流程涉及到了磷酸纖維素陰離子交換柱、肝素瓊脂糖親和層析柱、DEAE瓊脂糖柱、PEI柱四步上柱洗脫過程，最后再將NotⅠ在其存儲(chǔ)緩沖液中透析過夜，整個(gè)純化流程約需3～4d，