限制性?xún)?nèi)切酶BamHI及具有外切酶活性的phi29DNA聚合酶有滾環(huán)擴(kuò)增中的應(yīng)用.pdf

1、核酸作為重要的生物大分子之一，以一種遺傳信息的形式在生物體內(nèi)發(fā)揮各種功能，是從親代向子代傳遞信息的物質(zhì)基礎(chǔ)。核酸的合成、切割、連接、變構(gòu)、修飾等眾多反應(yīng)在細(xì)胞生命進(jìn)程中無(wú)時(shí)不在，這對(duì)于維持正常基因組的復(fù)制及修復(fù)、實(shí)施基因表達(dá)的調(diào)控具有重要的意義。許多酶也參與了各種細(xì)胞生命進(jìn)程，這些酶具有獨(dú)特的酶活性，比如聚合酶、內(nèi)切酶、連接酶、外切酶等，它們?cè)诨A(chǔ)研究和應(yīng)用研究中的應(yīng)用非常廣泛。
　　傳統(tǒng)的酶活性檢測(cè)方法為瓊脂糖凝膠電泳、親和力分

2、析、高效液相色譜以及酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定。這些方法具有連續(xù)性差、靈敏度低、檢測(cè)過(guò)程長(zhǎng)以及人工參與多等缺點(diǎn)。在本研究中，我們使用以熒光共振能量轉(zhuǎn)移為原理的方法對(duì)限制性核酸內(nèi)切酶進(jìn)行測(cè)定。限制性?xún)?nèi)切酶切割DNA在生命活動(dòng)中是十分常見(jiàn)的生物學(xué)事件。然而核苷酸衍生物對(duì)限制性?xún)?nèi)切酶的影響尚不清楚。我們利用熒光共振能量轉(zhuǎn)移的方法對(duì)2'-甲氧基核苷酸和2'-氟代核苷酸對(duì)限制性?xún)?nèi)切酶BamHⅠ和BglⅡ的酶切效率的影響進(jìn)行研究。
　　生命科學(xué)的高速發(fā)

3、展需要先進(jìn)的核酸分析和檢測(cè)技術(shù)以完成高靈敏度和高特異性的檢測(cè)，而傳統(tǒng)的檢測(cè)方法往往難以實(shí)現(xiàn)。滾環(huán)擴(kuò)增是新興的一種體外核酸擴(kuò)增技術(shù)。它只需在常溫下進(jìn)行，操作簡(jiǎn)單易行。此外，以G-四鏈體為基本框架的化學(xué)發(fā)光可視化檢測(cè)也日益受到了人們的關(guān)注。
　　在本文，我們首先對(duì)滾環(huán)擴(kuò)增中所用的phi29 DNA聚合酶進(jìn)行了研究。Phi29DNA聚合酶鏈具有5'-3'聚合酶特性以及3'-5'外切酶校讀功能。我們利用phi29DNA聚合酶的3'-外切酶

4、活性對(duì)靶核酸片段上3'末端的非互補(bǔ)序列進(jìn)行剪切，考察不同長(zhǎng)度的非互補(bǔ)序列對(duì)滾環(huán)擴(kuò)增效率的影響，并成功地對(duì)含有G2677T/A核苷酸序列進(jìn)行了SNP檢測(cè)。
　　其次，我們利用G-4 DNA和hemin構(gòu)建了DNAzyme檢測(cè)體系，利用核苷酸衍生物對(duì)環(huán)形模板實(shí)施保護(hù)，對(duì)滾環(huán)擴(kuò)增的長(zhǎng)鏈產(chǎn)物進(jìn)行了酶切處理，對(duì)DNAzyme的形成條件進(jìn)行了優(yōu)化，實(shí)現(xiàn)了可視化檢測(cè)。
　　材料與方法:
　　1、圓二色譜分析:
　　利用JASC

5、O-810型圓二色光譜儀(JASCO，Japan)用來(lái)測(cè)定樣品在溶液中所形成的二級(jí)結(jié)構(gòu)特征曲線(xiàn)。
　　2、紫外吸收及熔解曲線(xiàn)分析:
　　利用紫外分析儀（Varian cary300型）檢測(cè)修飾與未修飾雙鏈的穩(wěn)定性，測(cè)定Tm值等相關(guān)參數(shù)，考察修飾后雙鏈的穩(wěn)定性是否對(duì)酶切實(shí)驗(yàn)有影響。
　　3、熒光共振能量轉(zhuǎn)移分析:
　　利用熒光共振能量轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)(fluorescence resonance energy transf

6、er, FRET)分析甲氧基核苷酸和氟代核苷酸對(duì)底物進(jìn)行修飾后對(duì)限制性核酸內(nèi)切酶的影響。并計(jì)算了兩個(gè)重要的動(dòng)力學(xué)參數(shù)——Vmax和Km。
　　4、DNAzyme方法:
　　G-4 DNA能夠與氯化血紅素結(jié)合形成具有過(guò)氧化物酶活性的模擬酶復(fù)合物，可催化H2O2氧化2，2-吖嗪雙（3-乙基-7-苯并噻唑啉磺酸）二銨鹽(ABTS)，從而使體系的顏色發(fā)生變化。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　1、BamHI的酶濃度與酶切反應(yīng)初速度之

7、間具有良好的線(xiàn)性關(guān)系。2'-甲氧基核苷酸（2'-OMeNA）對(duì)BamHI識(shí)別序列GGATCC修飾的酶切阻滯效應(yīng)均具有位點(diǎn)依賴(lài)性。2'-甲氧基核苷酸修飾BamHⅠ-T4位點(diǎn)的底物抑制酶切反應(yīng)，而G1、C5和C6位點(diǎn)修飾的底物可以促進(jìn)酶切反應(yīng)。
　　2、BglⅡ的酶濃度與酶切反應(yīng)初速度之間具有良好的線(xiàn)性關(guān)系。2'-甲氧基核苷酸(2'-OMeNA)對(duì)BglⅡ識(shí)別序列AGATCT修飾的酶切阻滯效應(yīng)也具有位點(diǎn)依賴(lài)性。2'-甲氧基核苷酸修飾B

8、glⅡ-T4位點(diǎn)底物仍可阻滯酶切反應(yīng)，A1和A3位點(diǎn)修飾的底物可促進(jìn)酶切反應(yīng)。
　　3、2'-氟代核苷酸修飾時(shí)，BamHI和BglⅡ的各個(gè)修飾底物無(wú)一例外地阻礙酶切反應(yīng)，只是阻滯程度不同。
　　4、在滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)中，2'-甲氧基核苷酸修飾BamHI-T4位點(diǎn)可以保護(hù)環(huán)形模板，但是BamHI仍然可以剪切在滾環(huán)擴(kuò)增過(guò)程中產(chǎn)生的長(zhǎng)鏈DNA成為短鏈，使得剪切產(chǎn)物能夠形成G-四鏈體，為DNAzyme的檢測(cè)信號(hào)得到實(shí)現(xiàn)。
　　5、

9、利用phi29 DNA聚合酶的外切酶活性，可以對(duì)靶核酸片段上3'末端的非互補(bǔ)序列進(jìn)行剪切，對(duì)滾環(huán)擴(kuò)增效率不產(chǎn)生太大的影響。
　　結(jié)論:
　　1、利用2'-甲氧基核苷酸或2'-氟代核苷酸對(duì)內(nèi)切酶底物進(jìn)行修飾，可以使限制性核酸內(nèi)切酶BamHI及Bg/Ⅱ發(fā)生不同的酶切效應(yīng)。2'-甲氧基核苷酸修飾底物可以調(diào)節(jié)限制性核酸內(nèi)切酶BamHI的活性，有助于在合成生物學(xué)中用于構(gòu)建新的生物系統(tǒng)。
　　2、在滾環(huán)擴(kuò)增中，2'-甲氧基核苷酸修