生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)電泳技術(shù)原理

1、電泳原理與技術(shù),移動(dòng)界面電泳(moving boundary electrophoresis)區(qū)帶電泳(zone electrophoresis)穩(wěn)態(tài)電泳(steady state electrophoresis),其中以區(qū)帶電泳為目前常用的電泳系統(tǒng)。,依據(jù)技術(shù)原理，電泳可分三種形式:,任何電泳技術(shù)方法，均是以某種載體或支持介質(zhì)作為樣品中蛋白質(zhì)的泳動(dòng)跑道，在一定溫度、pH條件下、穩(wěn)定的靜電場(chǎng)中實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品中蛋白質(zhì)的分離，進(jìn)而進(jìn)行分析。

2、,?電泳支持介質(zhì)必須具有：化學(xué)惰性、不干擾大分子的電泳過(guò)程，化學(xué)穩(wěn)定性好、均勻、重復(fù)性好、電內(nèi)滲小等特性。,常見(jiàn)凝膠電泳的支持介質(zhì)：,?聚丙烯酰胺凝膠（polyacrylamide gel, PAG)由丙烯酰胺和交聯(lián)劑N，N’-甲叉雙丙烯酰胺在引發(fā)劑和增速劑的作用下，聚合而成。未交鏈的單體丙烯酰胺屬神經(jīng)性毒素，并具有致癌作用，實(shí)驗(yàn)過(guò)程注意盡可能避免中毒。實(shí)驗(yàn)過(guò)程簡(jiǎn)單，儀器設(shè)備叫貴重，但分辨率很高，重復(fù)性強(qiáng)。主要用于蛋白質(zhì)、酶、小分子核酸

3、等分離分析。,?瓊脂糖凝膠：從瓊脂中精制分離出的膠狀多糖，其分子結(jié)構(gòu)大部分是由1，3連接的β-D吡喃半乳糖和1,4連接的3,6脫水?-D吡喃半乳糖交替形成。試劑昂貴，方法簡(jiǎn)單，分辨率較高。主要用于DNA分離分析。,?淀粉凝膠：1～5%淀粉凝膠作為載體可對(duì)一定分子量的蛋白質(zhì)進(jìn)行有效分離。成本低，簡(jiǎn)單。主要用于同工酶等分離分析。,一、醋酸纖維薄膜電泳,,1.操作技術(shù)要領(lǐng)：,(1).醋酸纖維薄膜前處理,(2).點(diǎn)樣：點(diǎn)樣2～3?l；點(diǎn)樣量多少

4、直接影響分離效果，控制點(diǎn)樣量是試驗(yàn)成功的關(guān)鍵。點(diǎn)樣位置合理：距離薄膜一端約2cm樣線上平行點(diǎn)樣，2～3個(gè)樣點(diǎn)基本保持在一條線上。,商品薄膜在pH8.6巴比妥緩沖液浸泡1h以上。取出后，小塊濾紙對(duì)折吸取薄膜表面多余的緩沖液，進(jìn)行點(diǎn)樣。,(3).醋酸纖維薄膜置于電泳槽,樣點(diǎn)一端貼陰極鹽橋(黑線端)，非點(diǎn)樣端置于陽(yáng)極鹽橋(紅線)排除氣泡壓實(shí)(確保薄膜與電極接觸良好)。,(4).電泳：80～100V；35～50min。,pH8.6巴比妥緩沖液

5、,培養(yǎng)皿,,醋酸纖維薄膜,,,,,-,+,,,點(diǎn)樣線懸空切勿接觸(近)濾紙,(5).染色,薄膜浸泡于氨基黑溶液中5～10min。,(6).脫色,薄膜浸泡于漂洗液中進(jìn)行漂洗，至背景為乳白色。,(7).薄膜干燥,(8).透明,薄膜浸泡于透明液中10～30s，及時(shí)取出貼于干凈玻板上，排氣泡。慢加熱，逐步烘干。,(9).分析,薄膜從玻板上取下，進(jìn)行分析。,Alb(清蛋白),?-球蛋白,?-球蛋白,?1-球蛋白,?2-球蛋白,薄膜置于烘箱完全干燥

6、。,,-,+,Alb(白蛋白),?-球蛋白,?-球蛋白,?1-球蛋白,?2-球蛋白,各組分構(gòu)成,白蛋白,?1-酸性糖蛋白；?1-抗胰蛋白酶；,HP；CP；?-巨球蛋白；脂蛋白；,轉(zhuǎn)鐵蛋白；補(bǔ)體系統(tǒng)；β脂蛋白,IgG；IgM；IgA；IgD；IgE,正常參考值,Alb：57%～68%,?1：1.0%～5.7%,?2：4.9%～11.2%,β：7%～13%,?：9.8%～18.2%,凝膠成像系統(tǒng)拍照及掃描分析結(jié)果,2.醋酸纖維薄膜電泳分離人

7、血清蛋白質(zhì)原理,Alb(白蛋白),?-球蛋白,?-球蛋白,?1-球蛋白,?2-球蛋白,4.64,5.06,5.06,5.12,6.85～7.3,69,200,300,90～150,156～950,-,+,,,在pH8.6條件下血清中哪種蛋白質(zhì)在電場(chǎng)中向陽(yáng)極移動(dòng)最快？,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,分子量相同時(shí)，帶負(fù)電荷越多者移動(dòng)較快；相同等電點(diǎn)時(shí)，分子量較小者向異極移動(dòng)較快。,?1比?2球蛋白分子量小，向陽(yáng)極移動(dòng)快

8、！,Alb(白蛋白),?-球蛋白,?-球蛋白,?1-球蛋白,?2-球蛋白,-,+,%,57-72,2-5,4-9,6-12,12-20,polyacrylamide gel electrophoresis,二、聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE),不同蛋白質(zhì)由于帶電性質(zhì)、分子顆粒大小及形狀不同，在聚丙烯酰胺凝膠(PAG)中，向異極泳動(dòng)速度快慢不同，經(jīng)過(guò)電泳最終被分開(kāi)。由于蛋白質(zhì)在凝膠系統(tǒng)分離過(guò)程中存在濃縮效應(yīng)、電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)，因此，PA

9、GE法是分離、分析蛋白質(zhì)較好的技術(shù)方法之一。,（一）PAGE技術(shù)流程簡(jiǎn)介,,,,,,,2.制膠,1.組架,3.點(diǎn)樣,4.電泳,5.染色,6.脫色,7.分析,玻板,膠條,U型玻板,封膠,分離膠溶液,濃縮膠溶液,插入梳子,,,,,電極緩沖液,電極緩沖液,通常采用過(guò)硫酸銨或核黃素來(lái)引發(fā)該過(guò)程,以N,N,N’,N’-四甲基乙二胺(Tetranmethylenediamine,TEMED)為增速劑。該引發(fā)-增速的催化系統(tǒng)實(shí)質(zhì)是自由基催化的氧化-還

10、原過(guò)程。其結(jié)果是液態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)橹鸩侥z凝的半固體狀態(tài)。凝膠形狀取決于模具。,（二）丙烯酰胺凝膠聚合原理與凝膠結(jié)構(gòu),甲叉雙丙烯酰胺,+,丙烯酰胺,膠聯(lián)單體,膠聯(lián)劑,,過(guò)硫酸銨,TEMED,聚丙烯酰胺凝膠,具備立體的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),立體的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中網(wǎng)眼大小與凝膠濃度相關(guān):,膠濃度T=,膠聯(lián)度C=,a:丙烯酰胺(單體)的量(g),b:甲叉雙丙烯酰胺(交聯(lián)劑)的量(g),m:a+b所在緩沖溶液總體積(ml),,凝膠內(nèi)均勻的立體的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)示意圖,凝膠中網(wǎng)眼的

11、大小與膠的濃度有關(guān)，膠的濃度越小，其網(wǎng)眼越大，膠的濃度越大網(wǎng)眼越小。一般常規(guī)膠濃度為8%-10%。分離分析較小的蛋白質(zhì)分子時(shí)用較高濃度的凝膠，而分離分析分子量較大的蛋白質(zhì)時(shí)則用較大濃度的凝膠。,凝膠濃度與有效分離蛋白質(zhì)分子量之間的關(guān)系,分離膠濃度太大，孔徑小于樣品分子尺寸，電泳時(shí)蛋白質(zhì)分子不能進(jìn)入凝膠，樣品仍留在加樣位置；分離膠濃度太小，孔徑太大，樣品中各種蛋白質(zhì)分子受到的分子篩效應(yīng)減小，不能得到很好的分離；因此實(shí)驗(yàn)過(guò)程需要根據(jù)樣品中

12、被分析的蛋白質(zhì)分子大小適當(dāng)進(jìn)行設(shè)計(jì)。,引發(fā)劑和增速劑的濃度：濃度小易導(dǎo)致聚合速度慢；濃度過(guò)大則易導(dǎo)致電泳時(shí)的燒膠以及電泳帶的畸變；一般控制使聚合過(guò)程在40~60分鐘內(nèi)完成。,系統(tǒng)pH值：酸性條件、堿性條件均可，但仍然存在一個(gè)最佳pH值，以獲得最佳的聚合結(jié)果；,溫度：低溫下聚合導(dǎo)致凝膠變脆和混濁；適當(dāng)提高溫度可以是凝膠透明而有彈性；分子氧：分子氧的存在會(huì)阻礙凝膠的化學(xué)聚合；抽氣系統(tǒng)純度：金屬離子會(huì)影響凝膠的聚合；,,（三）影響凝膠聚合

13、速度主要因素,（四）PAGE分離蛋白質(zhì)原理,PAG系統(tǒng)電泳分離蛋白質(zhì)具有很高的分辨率，因?yàn)樵撓到y(tǒng)工作狀態(tài)下存在三種效應(yīng)，這三種效應(yīng)與凝膠系統(tǒng)pH不連續(xù)性及凝膠網(wǎng)眼大小有關(guān)。,1.濃縮效應(yīng),電極緩沖液Tris-HCl(pH8.5)濃縮膠為的pH6.5，通電后樣品中的各種帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)會(huì)在快離子(Cl-)和慢離子形成的高壓帶之間初步分開(kāi)并形成很窄的條帶，而整個(gè)樣品中的蛋白質(zhì)在將進(jìn)入分離膠時(shí)會(huì)形成一條細(xì)線，即被濃縮之效果。,2.電荷效應(yīng),3

14、.分子篩效應(yīng),樣品,,,,,甘氨酸緩沖液,濃縮膠(網(wǎng)眼大),,甘氨酸緩沖液,分離膠(網(wǎng)眼小),,,,pH8.5,pH6.5,pH8.9,,,,,,玻板組成的三明治模具(1mm厚),電泳槽,,2.電荷效應(yīng),3.分子篩效應(yīng),在設(shè)置好的濃縮膠及分離膠特定pH條件下，不同蛋白質(zhì)所帶電荷多少不同，并在穩(wěn)定的靜電場(chǎng)中向異極泳動(dòng)的動(dòng)力所決定的泳動(dòng)速度不同，最終會(huì)被分離。,分離膠內(nèi)屬于立體的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，分子量較大的蛋白質(zhì)顆粒向異極泳動(dòng)受到的阻力較大，泳動(dòng)

15、較慢，而分子量較小的蛋白質(zhì)則阻力較小，向異極涌動(dòng)較快，最終被分開(kāi)。,（五）影響蛋白質(zhì)泳動(dòng)速度及分離效果主要因素,1.系統(tǒng)的pH值,凝膠體系及電極緩沖液的pH決定樣品中蛋白質(zhì)的帶電性質(zhì)，直接影響蛋白質(zhì)的電泳方向和泳動(dòng)速度。pH一般設(shè)置成大于樣品中蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)，蛋白質(zhì)均荷負(fù)電，電泳方向朝陽(yáng)極。而當(dāng)pH小于樣品中蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)時(shí)，則所有蛋白質(zhì)分子荷正電，靜電場(chǎng)中向陰極泳動(dòng)。前一種電泳系統(tǒng)屬于堿性電泳，后者成為酸性電泳。,2.電場(chǎng)強(qiáng)度,普通電

16、泳,高壓電泳,5～20V/cm電壓降(電位梯度)。,70～200V/cm電壓降(電位梯度)。,直接影響蛋白質(zhì)泳動(dòng)速度的主要因素。,3.溫度,電泳過(guò)程中由于電流作用致使凝膠發(fā)熱，熱效應(yīng)對(duì)電泳有很大影響。溫度升高時(shí)介質(zhì)粘度下降，分子熱運(yùn)動(dòng)加劇，自由擴(kuò)散變快，有效遷移率增加，但對(duì)于蛋白質(zhì)分離不利。另外較高溫度會(huì)使凝膠變形，分子篩效應(yīng)降低，影響分離。因此，一般要求在15-25℃之間進(jìn)行電泳效果較好。,4.電滲作用,電泳介質(zhì)或支持物(如凝膠)在電

17、極緩沖液中吸附帶電離子，使溶液相對(duì)帶電，進(jìn)而在電場(chǎng)作用下，溶液就會(huì)向一定方向移動(dòng)，這種想象稱為電滲現(xiàn)象。帶電溶液的移動(dòng)會(huì)影響蛋白質(zhì)的泳動(dòng)。,sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,三、SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE),蛋白質(zhì)受還原劑作用解開(kāi)二硫鍵，同時(shí)受SDS作用處于變性狀態(tài)，在聚丙烯酰胺凝膠中，向亦極泳動(dòng)速度快慢主要是按照分子顆粒從小到大小依次排

18、開(kāi)得以分離的技術(shù)方法。,十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳,設(shè)備簡(jiǎn)單、操作簡(jiǎn)便、快速、重復(fù)性好、樣品無(wú)需純化。由于同時(shí)存在三種效應(yīng)，因此分辨率和檢出靈敏度高。,技術(shù)主要特點(diǎn)：,技術(shù)主要應(yīng)用范圍：,除了分離分析蛋白質(zhì)亞基種類(lèi)、表達(dá)劑量之外，還可用于測(cè)定未知蛋白質(zhì)亞基分子量。,（一）SDS-PAGE 分離基本原理,蛋白質(zhì)分子的解聚,SDS是一種陰離子去污劑，作為變性劑和助溶性試劑，能斷裂分子內(nèi)和分子間的氫鍵，使分子去折疊，破壞蛋白質(zhì)分子的二

19、級(jí)、三級(jí)結(jié)構(gòu)；而強(qiáng)還原劑，如二硫蘇糖醇、β-巰基乙醇能使半胱氨酸殘基之間的二硫鍵斷裂。,在樣品和凝膠中加入SDS和還原劑后，蛋白質(zhì)分子被解聚為組成它們的多肽鏈，解聚后的氨基酸側(cè)鏈與SDS結(jié)合后，形成帶負(fù)電的蛋白質(zhì)-SDS膠束，所帶電荷遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)了蛋白質(zhì)原有的電荷量，消除了不同分子間的電荷差異；同時(shí)，蛋白質(zhì)-SDS聚合體的形狀也基本相同，這就消除了在電泳過(guò)程中分子形狀對(duì)遷移率的影響。因此，SDS-PAGE過(guò)程中蛋白質(zhì)分子在凝膠中的泳動(dòng)速度主

20、要取決與亞基的分子量大小。與PAGE技術(shù)方法相似，蛋白質(zhì)亞基在電泳過(guò)程中存在三效應(yīng)。,,蛋白質(zhì)樣品用SDS處理后亞基的解聚和分子形狀的改變：,（二）未知蛋白質(zhì)分子量的測(cè)定,以不同分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳得到不同標(biāo)準(zhǔn)蛋白的電泳遷移率，制作標(biāo)準(zhǔn)校正曲線，然后對(duì)未知蛋白在相同條件下進(jìn)行SDS-PAGE電泳，測(cè)定遷移率，從標(biāo)準(zhǔn)曲線得到相應(yīng)的分子量；,,,,,,,,,,相對(duì)遷移距離(Relative migration,cm),

21、logMr,,Unknown protein,,,1.電泳槽：是凝膠電泳系統(tǒng)的核心部分，管式電泳槽、垂直板電泳槽、水平板電泳槽,四、電泳常規(guī)設(shè)備,2.電源:,3.脫色、染色槽,4.凝膠成像分析系統(tǒng),思考題：,1.常見(jiàn)的凝膠電泳有哪幾種？說(shuō)明其主要用途，并比較其主要優(yōu)缺點(diǎn)。,2.簡(jiǎn)單說(shuō)明PAGE技術(shù)方法對(duì)于樣品中蛋白質(zhì)的分離效果較好的主要因素有哪些，并簡(jiǎn)單解釋相應(yīng)因素產(chǎn)生的有原因。,3.從分離原理和實(shí)際應(yīng)用兩方面簡(jiǎn)單說(shuō)明SDS-PAGE和