實驗四pcr及電泳技術(shù)

1、1. PCR的基本原理,PCR基本原理 類似于DNA的體內(nèi)復(fù)制。在模板DNA、引物和4種脫氧核苷酸存在條件下依賴于DNA聚合酶的酶促合成反應(yīng)。PCR的基本步聚　 　1、變性 (Denaturation) ：通過加熱使DNA雙螺旋的氫鍵斷裂，雙鏈解離形成單鏈DNA 。 2、退火 (Annealing) ：當(dāng)溫度突然降低時，反應(yīng)體系中引物和其互補(bǔ)的DNA模板在局部形成雜交鏈。 3、延伸 (Extension )：在D

2、NA聚合酶和4種脫氧核苷酸(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)及Mg2+存在條件下，5’→3’的聚合酶催化以引物為起始點(diǎn)的DNA鏈延伸反應(yīng)。 這種熱變性-復(fù)性-延伸的過程就是一個PCR循環(huán)，PCR就是在合適條件下的這種循環(huán)的不斷重復(fù)。,PCR Cycle - Step 1 - Denaturation Template DNA by Heat (95℃),Target Sequence,Target Seq

3、uence,PCR原理示意圖,① 模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至93℃左右一定時間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備；,ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC,TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG,ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC,TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG,,加熱94℃,引物酶

4、,② 模板DNA與引物的退火(復(fù)性)：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對結(jié)合；,PCR Cycle - Step 2 –Temperature is lowered (Tm ) and primers anneal to target sequences,Target Sequence,Target Sequence,Primer 1,Primer 2,5’,3’,5’,5’,3’,5’

5、,3’,3’,引物酶,,3’,5’,,3’,5’,TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG,引物,ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC,引物,3’,5’,5’,3’,,PCR Cycle - Step 3 - At 72 ℃ Taq DNA polymerase catalyses primer extension as complementary nucleotides are incorporated

6、,Target Sequence,Target Sequence,Primer 1,Primer 2,5’,3’,5’,5’,3’,5’,3’,3’,Taq DNAPolymerase,③ 引物的延伸：DNA模板--引物結(jié)合物在Taq DNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA 鏈。,,3’,5’,,3’,5’,TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG

7、,ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC,,ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC,DNA聚合酶,TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG,DNA聚合酶,5’,5’,3’,3’,引物,引物,End of the 1st PCR Cycle –Results in two copies of target sequence,Target Sequence,Target Sequence,每

8、完成一個循環(huán)需2-4 min， 2-3 h就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬倍。,,,3’,5’,,3’,5’,TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG,ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC,,ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC,TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG,5’,5’,3’,3’,Target Amplification,No. ofNo. Amplicon

9、 CyclesCopies of Target122438416532664201,048,576301,073,741,824,1 cycle = 2 Amplicon,2 cycle = 4 Amplicon,3 cycle = 8 Amplicon,4 cycle = 16 Amplicon,5 cycle = 32 Amplicon,6 cycle = 64 Amplicon,7 cycle =

10、 128 Amplicon,,,,,,,,,,,,PCR儀,PCR儀,PCR儀,1、PCR反應(yīng)成分,1）模板 單、雙鏈DNA或RNA都可以作為PCR的樣品。若起始材料是RNA，須先通過逆轉(zhuǎn)錄得到第一條cDNA。 一般100ng DNA模板/100?l。模板濃度過高會導(dǎo)致反應(yīng)的非特異性增加。最好做濃度梯度對照從而確定最佳條件。,PCR反應(yīng)體系,模板引物Taq DNA聚合酶4種dNTP混合物Mg2+10×

11、;緩沖液,,2）引物 （1）濃度 0.1-0.5 ?M 濃度過高易導(dǎo)致模板與引物錯配，反應(yīng)特異性下降。,,引物是PCR特異性反應(yīng)的關(guān)鍵；PCR產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板脫氧核糖核酸互補(bǔ)的程度；人工合成的寡聚核苷酸引物需經(jīng)離子交換HPLC進(jìn)行純化。,3）Taq DNA聚合酶一般0.5-2.5 U/50?l；酶量過少影響反應(yīng)產(chǎn)量；濃度過高可引起會造成雜帶、特異產(chǎn)物帶不清晰等不好的結(jié)果，濃度過低則得不到所需的產(chǎn)

12、物。最可靠的做法是先做濃度對照,再根據(jù)結(jié)果決定最佳條件。,4）dNTP (dATP、dCTP、dGTP、dTTP 4） dNTP濃度取決于擴(kuò)增片段的長度; 四種dNTP濃度應(yīng)相等; PCR常用的濃度為50-200μM，不能低于10-15μM。 濃度過高會抑制Taq 酶的活性，易產(chǎn)生錯誤堿基的 摻入，濃度過低則降低反應(yīng)產(chǎn)量,5）10×PCR緩沖液 (Mg2+)： 500 mM KCl，

13、 100 mM Tris-HCl (pH 8.4)， 150 mM MgCl2 ， 1 mg/ml明膠。,,PCR反應(yīng)體系： 10×PCR buffer 2.5μl dNTP mix 各0.5μl 引物1

14、 0.5 μl 引物2 0.5 μl DNA模板 2 μl Taq 酶 0.5 μl 加雙蒸水至

15、總體積為25μl,PCR擴(kuò)增程序:,94℃, 300S 94℃, 60S 55℃

16、, 60S 72℃, 60S 72℃, 7min,,,,,,30 循環(huán),2. 電泳技術(shù),電泳槽,制膠板,梳子,電源,電泳儀,,,,,提供穩(wěn)定的電壓或電流,電極緩沖液和凝膠的容器,形成點(diǎn)樣孔,制備垂直或水平凝膠,,,,,電泳分離的原理,電泳(electrophoresis)溶液中帶

17、電粒子(離子)在電場中移動的現(xiàn)象。 1、電荷效應(yīng) 利用帶電粒子在電場中移動速度不同而達(dá)到分離的目的。 2、分子篩效應(yīng) 不同的分離介質(zhì)形成的孔徑不同，在孔徑大的介質(zhì)中泳動速度快，相反則慢。 3、待分離生物大分子的性質(zhì) 一般來說，分子帶的電荷量越大、直徑越小、形狀越接近球形，則其電泳遷移速度越快。 4、電場強(qiáng)度 電場強(qiáng)度（V/cm）是每厘米的電位降，也稱電位梯度。電場強(qiáng)度越大，電泳速度越快。

18、,電泳技術(shù)的種類,按支持介質(zhì)的不同可分為： ⑴ 紙電泳(Paper electrophorisis) ⑵ 醋酸纖維薄膜電泳(Cellulose Acetate electrophoresis) ⑶ 瓊脂凝膠電泳(Agar Gel electrophoresis) ⑷ 聚丙烯酰胺凝膠電泳(Polyacrylamide Gel electrophoresis) (PAGE) ⑸ SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS－PAG

19、E)。,瓊脂糖凝膠電泳,對于雙鏈DNA，電泳遷移率的大小主要與DNA分子大小有關(guān) 。,1、熔化瓊脂糖時，宜低火，防暴沸；2、倒膠時溫度要低于60℃且速度要慢；3、拔梳子和點(diǎn)樣要小心，以免破壞膠孔；4、電泳儀打開前應(yīng)檢查電壓、電流旋紐是否處于零位置，工作電壓一般為60-80V，400mA，電泳完畢應(yīng)將電壓、電流旋鈕恢復(fù)到零位置；5、防止EB污染和紫外燈傷眼。,注意事項：,不同濃度大小瓊脂糖的有效分離范圍,精品課件！,精品課件！,M

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