免疫血液檢測

1、紅細胞血型檢測,新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院 三全 學(xué)院,主要內(nèi)容,輸血前免疫血液學(xué)檢查鹽水介質(zhì)試驗技術(shù)酶處理試驗技術(shù)抗球蛋白試驗技術(shù)聚凝胺介質(zhì)試驗技術(shù)微柱凝集試驗技術(shù)吸收放散試驗?zāi)种圃囼?,教學(xué)目標(biāo),掌握輸血前免疫血液學(xué)檢查內(nèi)容掌握鹽水介質(zhì)、抗球蛋白試驗、聚凝胺介質(zhì)和微柱凝集試驗檢測方法試驗原理、結(jié)果判讀及注意事項熟悉吸收放散、凝集抑制試驗了解酶處理試驗和紅細胞血型分子生物學(xué)檢測技術(shù),第一節(jié)輸血前免疫血液學(xué)檢查,一、受血者標(biāo)本處

2、理二、受血者和供血者ABO和Rh定型三、不規(guī)則抗體的篩選和鑒定四、交叉配血試驗五、實驗結(jié)果的規(guī)范化報告,一、受血者標(biāo)本處理,（一）標(biāo)本的采集（二）標(biāo)本的接受 核對、詢問輸血史、妊娠史等、注明最后一次輸血日期（三）標(biāo)本的要求準(zhǔn)確無誤來自受血者和供血者防止受血者血液標(biāo)本稀釋和（或）溶血受血者標(biāo)本須輸血前3天采集；再次輸注時間隔24h，重新采集標(biāo)本輸血后，受血者和供血者標(biāo)本保存2~8℃至少7天,,1,4,4,2,4,3,

3、二、受血者和供血者ABO和Rh定型,ABO血型鑒定原理,正向定型：已知的特異性抗體（標(biāo)準(zhǔn)血清）檢查紅細胞的未知抗原,反向定型：已知的血型的標(biāo)準(zhǔn)紅細胞檢查血清中的未知抗體,ABO血型鑒定結(jié)果判斷,ABO正反定型不符分析基本程序,首先重復(fù)試驗重新采集獻血者與受血者血液標(biāo)本查詢受血者既往病史及輸血史和用藥史等多次洗滌標(biāo)本紅細胞應(yīng)用抗-AB、抗-A1、抗-H檢測紅細胞分析O型篩選細胞檢測結(jié)果,輸血治療的首要步驟組織器官移植新生兒溶

4、血病,ABO正反定型的臨床意義,復(fù)檢正定型血型結(jié)果的準(zhǔn)確性，糾正漏檢、誤報亞型能夠糾正因疾病原因造成的紅細胞抗原減弱造成的血型錯誤排除獲得性抗原（如類B抗原）和冷凝集現(xiàn)象對紅細胞定型的干擾不規(guī)則抗體,ABO反定型的臨床意義,錯加試劑或標(biāo)本,,,技術(shù)和操作,,受血者紅細胞或血清,ABO正反定型不一致的原因,試劑失效或污染,細胞與血清間比例不適當(dāng),溶血現(xiàn)象未能識別,,漏加試劑,結(jié)果記錄或判斷錯誤,,血清異常紅細胞致敏近期輸血

5、疾病導(dǎo)致抗原減弱抗體減弱不規(guī)則抗體年齡近期進行大量血漿置換治療,,RhD定型及其常見問題,,1.Rh定型RhD定型，試管法最經(jīng)典，多使用微柱凝膠卡2.RhD陰性確認IgM抗-D陰性,,三個廠家IgG抗-D進行確認,抗人球蛋白法進行確認三種IgG抗-D試劑均為陰性，報RhD陰性一種或一種以上IgG抗-D試劑為陽性，報弱D,三、不規(guī)則抗體的篩查與鑒定,,概念,（一）,,考察心得,2,,,不規(guī)則抗體鑒定,（三）,,,篩查方法

6、,（二）,,,影響因素,（四）,,,遇到的問題,五,不規(guī)則抗體的篩選和鑒定,患者血清+試劑篩選紅細胞 鹽水介質(zhì) 聚凝胺介質(zhì)（最為常用） 抗人球蛋白介質(zhì)（最為常用敏感） 酶介質(zhì)法,,要求和內(nèi)容結(jié)果解釋及處理方案影響因素,四、交叉配血試驗,,交叉配血的主次側(cè),接收申請單和血標(biāo)本,核對無誤（如有錯誤與醫(yī)生/護士聯(lián)系）,進行交叉配血,相合結(jié)果輸入微機,不相合,打印發(fā)血單,血液中心,,,,,,,,交叉配血工作流程,

7、五、試驗結(jié)果的規(guī)范化報告,血庫收到輸血申請單后，進行交叉配血試驗申請單：申請日期、需要血液的日期和時間、患者姓名、出生日期、性別、住院號、病房號等信息齊全，并申請人簽字發(fā)血單：受血者姓名、性別、病案號、ABO及Rh血型、供血者編號及血型、交叉配血實驗結(jié)果、發(fā)出血液品種及血量、發(fā)血日期及時間、配血者、發(fā)血者和取血者姓名雙方核對申請單、血液標(biāo)簽和血液外觀等,發(fā)血程序（常規(guī)和緊急情況）,1.常規(guī)情況下發(fā)血的一般程序 (1)臨床申請

8、 (2)血液新鮮程度的選擇(大量用血和新生兒) (3)血型的選擇(ABO、Rh、新生兒換血、不規(guī)則抗體篩檢) (4)交叉配血 (5)發(fā)血，做好記錄,發(fā)血程序（常規(guī)和緊急情況）,2.緊急情況下發(fā)血的一般程序 (1)快速檢血型，選ABO、Rh同型血 (2)標(biāo)記“未經(jīng)配血”字樣 (3)留供受者血樣 (4)發(fā)血后做好記錄 (5)與臨床保持聯(lián)系,第二節(jié) 鹽水介質(zhì)試驗技術(shù),本質(zhì)凝集反應(yīng)，直接凝集試驗檢測IgM

9、類抗體基本方法：平板法、試管法、微孔板法,結(jié)果判讀陽性：凝集或溶血陰性：紅細胞呈游離混懸狀態(tài),第二節(jié) 鹽水介質(zhì)試驗技術(shù),瓷板法,試管法,微孔板法,試管法結(jié)果判定,紅細胞凝集強度判斷標(biāo)準(zhǔn),第三節(jié) 酶處理試驗技術(shù),試驗原理酶試驗技術(shù)的分類結(jié)果判讀影響因素,第四節(jié) 抗球蛋白試驗技術(shù),抗人球蛋白試驗：又稱Coombs試驗，是診斷自身免疫性溶血性貧血的重要依據(jù)。主要用于檢測IgG、IgA等抗體參與的抗原-抗體反應(yīng)，也可測定補體

10、組分C3、C4片段參與的免疫反應(yīng)分類：直接抗球蛋白試驗和間接抗球蛋白試驗,抗球蛋白試驗原理,Coombs利用抗球蛋白抗體作為第二抗體，連接與紅細胞表面抗原結(jié)合的特異抗體，使紅細胞凝集。直接試驗：是檢查被檢紅細胞上有無不 完全抗體。間接試驗：是檢查血清中游離的不完全抗體,直接Coombs試驗,,,抗人免疫球蛋白,自身抗體,間接Coombs試驗,,,抗人免疫球蛋白,,,同種異型抗體,2不完全抗體可以結(jié)合在紅細胞

11、表面,但是不能和兩個紅細胞同時結(jié)合（致敏）。,3加入抗人球蛋白,1紅細胞彼此之間有一定的間距,4抗人球蛋白可以同時和兩個不完全抗體的FC段結(jié)合，從而把紅細胞連接在一起,2.抗人球蛋白交叉配血法示意圖,直接法： 常用于新生兒溶血癥、自身免疫性溶血癥、特發(fā)性自身免疫性貧血和醫(yī)源性溶血性疾病等的檢測。 間接法： 多用于檢測母體Rh（D）抗體，以便及早發(fā)現(xiàn)和避免新生兒溶血癥的發(fā)生。亦可對紅細胞不相容的輸血所產(chǎn)生的血型抗

12、體進行檢測。,抗球蛋白試驗原理,結(jié)果判讀,直接抗球蛋白試驗陽性對照管凝集，陰性對照管不凝集，被檢管凝集，判定為陽性陽性對照管凝集，陰性對照管不凝集，被檢管不凝集，需要做陰性確認后判定結(jié)果（無凝集的被檢管中加入IgG抗-D致敏紅細胞后離心，出現(xiàn)凝集判陰性，否則重新試驗陽性對照管不凝集和（或）陰性對照管凝集，結(jié)果不可信不發(fā)報告，分析原因重做,陽性對照管呈現(xiàn)凝集反應(yīng)，陰性對照管未呈現(xiàn)凝集反應(yīng)，被檢管呈現(xiàn)凝集反應(yīng)為陽性結(jié)果，被檢者血清內(nèi)含

13、有抗體，如果自身對照無凝集，同種抗體；如果被檢者結(jié)果陰性，被檢者血清中未被查出意外抗體。陽性對照管不凝集和（或）陰性對照管出現(xiàn)凝集，實驗失敗。,結(jié)果判讀,抗球蛋白試劑不純,,,假陽性,,假陰性,紅細胞洗滌已凝集,紅細胞質(zhì)量,不抗凝標(biāo)本,,漏加試劑,離心過度,,紅細胞、血清及試劑質(zhì)量洗滌不充分操作過程不連續(xù)離心過度紅細胞過多或過少血清濃度過大孵育時間和溫度不當(dāng)前帶現(xiàn)象,間接抗球蛋白試驗,鹽水保存不當(dāng),紅細胞直抗陽性,抗球蛋

14、白試驗的影響因素,抗體親和力孵育時間和溫度：IgG抗體、補體致敏37℃，30∽60min離子強度抗原抗體比例洗滌體外補體致敏紅細胞自身凝集,,第五節(jié) 聚凝胺介質(zhì)試驗技術(shù),聚凝胺介質(zhì)試驗技術(shù),是一種快速、簡便、紅細胞不完全抗體的方法多數(shù)IgG抗體能夠被檢出，但IgG抗-K抗體除外漢族至今未發(fā)現(xiàn)K抗原陽性，也未檢出抗-K抗體,紅細胞抗原抗體反應(yīng)過程,抗原抗體的靠近： 紅細胞抗原位點帶負電荷，抗體Fab端帶正電（K

15、ell系統(tǒng)抗原帶正電荷）抗原抗體的結(jié)合： 靜電引力、氫鍵、疏水鍵及范德華力,影響紅細胞抗原抗體反應(yīng)的因素,離子強度： 反應(yīng)液中的電解質(zhì)會增加溶液的介電常數(shù)，減弱抗原抗體間的靜電作用 降低離子強度可以顯著增加抗原抗體結(jié)合速率。如:離子強度由0.17M降到0.03M時，抗D和D陽性紅細胞的開始結(jié)合速率增加1000倍。,紅細胞表面電荷及其相互之間的距離,１.低離子強度作用原理,當(dāng)溶液中缺少離子時，抗原抗體之間的靜

16、電作用力強當(dāng)溶液中離子增多時，抗原抗體之間的靜電作用力弱,２.低離子聚凝胺交叉配血技術(shù),原理：聚凝胺（Polybrene），一種高價陽離子季胺鹽多聚物，溶解后能產(chǎn)生很多正電荷，可以中和紅細胞表面的負電荷，使紅細胞之間距離減少，能引起正常紅細胞可逆性的非特異性凝集。如果使抗體致敏的紅細胞被聚凝胺凝集，則凝集不可逆。,1 紅細胞間有一定間距,,2 加入聚凝胺后，可以縮短紅細胞之間的距離，使其非特異性凝集,3 加入枸櫞酸鈉，可以中和

17、聚凝胺,4 紅細胞的非特異性凝集消失,聚凝胺交叉配血技術(shù)示意圖1,,,聚凝胺,枸櫞酸鈉,1 紅細胞上已有不完全抗體致敏,2 加入聚凝胺后，縮短紅細胞之間的距離，讓不完全抗體可以同時與兩個紅細胞結(jié)合使其特異性凝集,3 加入枸櫞酸鈉中和聚凝胺,4 由于不完全抗體的結(jié)合，紅細胞的特異性凝集不消失,聚凝胺交叉配血技術(shù)示意圖2,,,,聚凝胺,枸櫞酸鈉,不完全抗體,注意事項,不能使用含枸櫞酸鈉和肝素抗凝標(biāo)本按比例加樣，非特異凝集60秒內(nèi)觀察結(jié)果

18、出現(xiàn)不配合試驗時，抗球蛋白重復(fù)，結(jié)果不一致時以抗球蛋白試驗結(jié)果為準(zhǔn)一般使用血清對Kell系統(tǒng)檢測不理想按照說明書,聚凝胺方法的特點,靈敏：靈敏度高速度快：實驗時間5分鐘左右準(zhǔn)確：準(zhǔn)確度高于酶試驗不適合于Kell系統(tǒng)抗體的檢測，但黃種人群中Kell系統(tǒng)抗體極罕見操作要求較高,第六節(jié)微柱凝膠實驗技術(shù),凝膠技術(shù)的原理,,,,凝膠技術(shù)的原理：,A、反應(yīng)室：下端底孔很小，液體在孵育過程中不會流入下方微柱中。B、試劑或鹽水層：紅細

19、胞在離心力作用下穿越該層，紅細胞與反應(yīng)室中的血清分離并與該層液體中的試劑反應(yīng)。C、粘液：親和柱中有一層粘液，作用與“試劑或鹽水層”相同。,原理：凝膠分子篩和親和效應(yīng)微柱凝膠柱中填充凝膠（葡聚糖），及相應(yīng)試劑（抗體或抗原）。凝膠分子間的間隙只允許游離紅細胞通過，分子排阻層析原則將發(fā)生凝集反應(yīng)的紅細胞阻滯于凝膠之內(nèi)，而未凝集的游離紅細胞則穿過微孔運動到管底，從而判定有無凝集反應(yīng)。,結(jié)果判定,新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第三臨床檢驗教研室,結(jié)果判定,簡便

20、準(zhǔn)確敏感：在凝膠試驗中常能發(fā)現(xiàn)其它試驗不易發(fā)現(xiàn)的問題。結(jié)果可保存 凝膠試驗的結(jié)果可在冰箱中保存數(shù)日，并且較容易被拍成照片。操作技術(shù)要求較低：凝膠試驗的操作主要是簡單的加樣和判讀，孵育、離心過程都有專門的設(shè)備。其中能被人為改變的因素較少。無需洗滌的抗人球蛋白試驗,優(yōu)點：,第七節(jié) 吸收放散試驗,吸收試驗原理,待檢紅細胞,已知效價的抗A或抗B血清,,吸收液,,已知抗原的紅細胞,,,滴定,比較吸收前后血清中抗

21、體效價,,紅細胞上有無相應(yīng)抗原及其強度,,間接判定待檢紅細胞血型及其亞型種類,熱放散試驗原理,待檢紅細胞,分型血清,,物理條件的改變（加熱）,抗體,待檢紅細胞,試 劑紅細胞,,,確定抗體的種類和強度,,判定待檢紅細胞上抗原的型別,放散,凝集或致敏,,吸收放散試驗應(yīng)用,證實存在于紅細胞上的弱抗原分離、鑒定混合抗體除去血清中不需要的抗體濃縮低效價抗體核實抗體特異性鑒定新生兒溶血病和免疫性輸血反應(yīng)的抗

22、體研究鑒別免疫性溶血性貧血的抗體,第八節(jié) 凝集抑制試驗,凝集抑制試驗,可溶性血型物質(zhì)：血型抗原除了存在于人體的紅細胞膜上以外，某些也以游離形式存在于血漿、尿液等液體中。ABH、P物質(zhì)等與對應(yīng)的血型抗體結(jié)合，可中和該抗體，或使該抗體凝集對應(yīng)紅細胞的能力受到抑制，成為凝集抑制試驗,凝集抑制試驗原理,分泌型、非分泌型證明可溶性ABH或Lewis抗原存在鑒定體液和（或）非紅細胞上血型物質(zhì)時，利用這些血型物質(zhì)結(jié)合相應(yīng)抗體，再用紅細胞抗