實(shí)驗(yàn)-兩對(duì)半的檢測(cè)

1、ELISA檢測(cè)“乙肝二對(duì)半” (Enzyme linked immunosorbent Assay ELISA),,酶免疫技術(shù)分類,固相酶免疫測(cè)定,液相酶免疫測(cè)定,均相酶免疫測(cè)定,非均相酶免疫測(cè)定,ELISA的概念,酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) （enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）酶聯(lián)：抗原或抗體的酶標(biāo)記。免疫：以抗原抗體特異性反應(yīng)為基礎(chǔ)。吸附：抗原或抗體包被于

2、固相載體表面。 在固相載體表面實(shí)現(xiàn)抗原抗體的反應(yīng)，通過(guò)酶標(biāo)記的手段，酶催化底物形成水解、氧化或還原反應(yīng)，形成有色物質(zhì)，其顏色的深淺與標(biāo)本中的抗原或抗體的量直接相關(guān)。,,ELISA技術(shù)特點(diǎn),具有良好的靈敏度和特異性，能滿足臨床需要，應(yīng)用廣泛。操作簡(jiǎn)單、無(wú)需昂貴的儀器投入，價(jià)格便宜。對(duì)環(huán)境幾乎沒(méi)有污染。,ELISA技術(shù)的應(yīng)用,檢測(cè)抗原的方法：雙抗體夾心法競(jìng)爭(zhēng)法,檢測(cè)抗體的方法：雙抗原夾心法間接法競(jìng)爭(zhēng)法捕

3、獲法,實(shí)驗(yàn)?zāi)康?掌握ELISA法檢測(cè)“乙肝二對(duì)半” 的原理、操作步驟及注意事項(xiàng)。掌握檢測(cè)“乙肝二對(duì)半”的臨床意義。,什么是“乙肝二對(duì)半”？,“乙肝兩對(duì)半”是指：表面抗原（HBsAg）、表面抗體（HBsAb）、e抗原（ HBeAg ）、e抗體（HBeAb）、核心抗體（HBcAb）HBsAg本身不具有傳染性，只具有抗原性保護(hù)性抗體： HBsAb傳染性指標(biāo)： HBeAg ， HBcAgHBeAb， HBcAb不是保護(hù)性抗體，而是

4、反映曾被HBV感染的重要指標(biāo)。,為什么不檢測(cè)核心抗原（HBcAg）,HBcAg主要位于病毒顆粒中，只有少數(shù)游離。機(jī)體免疫系統(tǒng)對(duì)HBcAg很敏感，易產(chǎn)生高滴度的HBcAb,與HBcAg 形成免疫復(fù)合物。血清中， HBcAg可丟失部分氨基酸。,“乙肝二對(duì)半”的檢測(cè)原理,HBsAg：雙抗體夾心法HBsAb：雙抗原夾心法HBeAg：雙抗體夾心法HBeAb：中和競(jìng)爭(zhēng)法（血清中的e抗體與固相e抗體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合e抗原）HBcAb：

5、競(jìng)爭(zhēng)抑制法,雙抗原（體）夾心法測(cè)抗體（原）,,,Anti-HIV, Anti-HBs,,雙抗體夾心法,雙抗原夾心法,HBsAg ,HCV core Ag, HBeAg,HBV preS1,PreS2,,,,,,,,雙抗體夾心法測(cè)抗原,,+,-,Y,,Y,E,Y,,Y,Y,Y,Y,Y,,,,,Y,Y,,Y,Y,,,,Y,Y,Y,Y,Y,Y,,,競(jìng)爭(zhēng)抑制法測(cè)抗體,,,包被抗原,,,Anti-HBcAnti-HBe,,中和競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)抗體,,

6、,Anti-HBe,,試劑盒組成,包被反應(yīng)板：固相的抗原或抗體酶結(jié)合物：酶標(biāo)記的抗原或抗體顯色劑：分A、B二瓶終止液對(duì)照：陽(yáng)性對(duì)照，陰性對(duì)照濃縮洗滌液 中和試劑（只有檢測(cè)HBeAb的試劑盒才有）,實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備,配制洗滌液：用蒸餾水按1：20稀釋濃縮洗滌液。為節(jié)省試驗(yàn)時(shí)間，除檢測(cè)核心抗體（HBcAb）組外，其余組可在加樣后的溫育時(shí)間中才配制洗滌液。,實(shí)驗(yàn)操作,1、加樣：第一、二孔為陰

7、、陽(yáng)對(duì)照孔，分別加入陰、陽(yáng)對(duì)照50ul。其余各孔為樣品孔，各加入待測(cè)標(biāo)本50ul（檢測(cè)HBcAb 時(shí)，待測(cè)標(biāo)本需用稀釋后的洗滌液做1：30稀釋）。2、加中和試劑（只有檢測(cè)HBeAb時(shí)才需要）：每孔50ul3、加酶結(jié)合物：每孔50ul4、溫育：封板→充分混勻后置37°C水浴30分鐘5、洗滌：棄去反應(yīng)條孔內(nèi)液體，用洗滌液注満每孔，放置或振蕩1分鐘，棄去拍干→反復(fù)5次（注意：最后一次一定要拍干）6、顯色：每孔先加顯色劑A

8、50ul，再加顯色劑B 50ul，混勻后置37°C水浴10分鐘7、中止顯色：每孔加入中止液50ul8、判斷結(jié)果：,①目測(cè)法：,HBsAg， HBsAb， HBeAg,,,HBeAb ， HBcAb,,②比色法：波長(zhǎng)450nm讀取各孔OD值HBsAg， HBsAb， HBeAg 樣品OD值/陰性對(duì)照OD值≥2.1 HBeAb ， HBcAb陰性對(duì)照OD值/樣品OD值≥2.1（建議雙波長(zhǎng)比色（450/630nm

9、）；臨界值的確定請(qǐng)參考實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)，不同的試劑盒和檢測(cè)原理，臨界值的設(shè)定均不同）,陽(yáng)性,陽(yáng)性,ELISA的注意事項(xiàng),標(biāo)本：內(nèi)源性（RF、補(bǔ)體、嗜異性抗體等） 外源性因素（溶血、細(xì)菌污染、保存不當(dāng)、凝集不全、防腐劑NaN3等）（P229）試劑：試劑質(zhì)量、批號(hào)、是否失效（冰箱溫度）、平衡（37度°C30分鐘）、搖勻加樣：加樣準(zhǔn)確、不可太快，避免加在上部和產(chǎn)生氣泡。溫育：溫度（定期觀察與登記）、時(shí)間、濕度、封片（

10、不可重復(fù)用）洗板：洗滌液用蒸餾水或去離子水現(xiàn)配、防止洗板機(jī)堵塞、洗完要拍板。顯色：加試劑時(shí)不可重復(fù)加和漏加，或加在兩孔之間，不要產(chǎn)生氣泡，及時(shí)終止。比色：建議用雙波長(zhǎng)（可排除標(biāo)本濃度、干擾色、電路干擾、板底部劃痕的影響）。結(jié)果判定：反應(yīng)終止后10分鐘內(nèi)質(zhì)量控制：內(nèi)對(duì)照、室內(nèi)質(zhì)控、室間質(zhì)評(píng)等（全程質(zhì)控意識(shí)）表面抗原陽(yáng)性結(jié)果、灰區(qū)標(biāo)本、矛盾結(jié)果或少見(jiàn)模式均須復(fù)查生物安全：試劑盒應(yīng)視為有傳染性物質(zhì)，請(qǐng)按傳染病實(shí)驗(yàn)室檢查規(guī)程處理。