免疫預(yù)防

1、免 疫 預(yù) 防,一、概述,動物對病原體的免疫力可分為先天性免疫(innate immunify)和獲得性免疫cuquired immnanhy兩種。前者是動物在種族進(jìn)化過程中由于機(jī)體長期與病原體斗爭而建起的天然防御機(jī)能它可以和其他生物學(xué)特性一起遺傳；后者是動物機(jī)體在個體發(fā)育過程中受病原體及其產(chǎn)生的刺激而獲得的免疫力它具高度特異性。,二、天然非特異性免疫——這種非特異的不意受性是動物于生具有的，它是機(jī)體在長期的種族發(fā)育與進(jìn)行過程中，

2、不斷分列界入侵病原生等抗原物質(zhì)互相作用，逐步建立起來的，只稱為——先天性免疫，這種免疫功能許多動物都有元針對性，對微生物的作用范圍廣泛，機(jī)體的這種免疫性受遺傳基因控制是相對穩(wěn)定性，可和其他生物特性一起遺傳給后代，先天性免疫可表現(xiàn)多種問題一種的免疫，如牛不患豬病。 此外，在對于某種病原微生物易感的動物體內(nèi)，有個別的動物個體，對其卻具特殊抵抗力一個體免疫，如有些個體對某種病原微生物較之因種動物大多數(shù)是強(qiáng)得多的抵抗力。 三、獲得性免疫

3、可分主動和被動，二者又有天然的人工免疫，其中人工主動免疫一接觸疫 苗使動物獲得對某一傳染原的抵抗力——不僅在免疫學(xué)發(fā)展的早期，即使去進(jìn)入好免疫學(xué)的 今天——仍是免疫學(xué)研究的中心課題，,特異性免疫獲得的方法,,獲得性免疫,被動免疫,主動免疫,天然,人工,天然,人工,,,,,,,人工被動免疫,定義:將多次免疫的動物血清——免疫血清或天然發(fā)病后痊愈的血清、人工輸給其它的動物，使其獲得對某病原體的抵抗力——即人工被動免疫。免疫期不長，一般2

4、—4周。,免疫血清的制備,同種、異種動物(同種動物血清，后者為異種動物血清) 抗菌和抗毒素——多為異種血清、常用馬、牛大動物制抗病毒血清——多用同種動物制(免疫后不引起排異反應(yīng)免疫期較長—2周左右。,②應(yīng)用：,抗毒素—破份風(fēng) 病初—十分顯著； 癥狀明顯—輔助療法 抗菌血清 群發(fā)性強(qiáng)烈性感染病，緊急預(yù)防搶救可選方法 抗病毒血清在已感染群預(yù)防效果。 使用異

5、種動物血清時，必須注意過敏反應(yīng),2 母源抗體被動,——胎盤初乳卵黃 ①胎盤動物 ②初乳——對某些侵害初生的動物為主的傳染病，常用疫苗免疫懷孕期母苗，通過母源抗體保護(hù)，如大批死亡的小鵝病,,過繼免疫（細(xì)胞免疫）：過繼免疫治療：是將自身或異體的免疫物輸入患者，以達(dá)到增強(qiáng)機(jī)體免疫功能的目的。用于過繼免疫的物質(zhì)很多，包括免疫血清、免疫細(xì)胞、細(xì)胞因子如轉(zhuǎn)移因子、免疫核糖核酸等。,人工被動免疫制劑,抗毒素人免疫球蛋白制劑細(xì)胞因子制

6、劑,人工主動免疫,定義是用人工按種的方法給機(jī)體輸入抗原性物質(zhì)，刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生免疫應(yīng)答，從而增強(qiáng)抗病能力。特點(diǎn)：作用緩慢，但免疫力持久，半年至數(shù)年不等，隨疫苗種類而異)。 與被動免疫相比，主動免疫最重要的優(yōu)點(diǎn)—保護(hù)時間長，并可通過重復(fù)注射疫苗而使這種保護(hù)僅應(yīng)得到強(qiáng)化和延長。疫苗研究在防止傳染病的斗爭中取得了巨大的成績。但有它的局限性。 1首先疫苗研究必須搞清病原的基礎(chǔ)上進(jìn)行。 2其次必須搞清傳染病免疫反應(yīng)的性質(zhì)，

7、如馬傳貧，阿留申，這些病的免疫應(yīng)答本身就是造成疾病的過程。,,3應(yīng)用的疫苗不應(yīng)引起不利的后果，必須安全有效。 迫強(qiáng)、散毒 造成血清診斷紊亂,良好的疫苗還必須考慮以下因素：,1安全性好，無明顯的副反應(yīng) 2能產(chǎn)生堅強(qiáng)的免疫力(保護(hù)率高和保護(hù)時間長免疫期長) 3穩(wěn)定而易于保存 4使用簡便，易大面積防疫 5易制造，價格低廉,疫苗的要求,安全有效實(shí)用,疫苗研究鑒定和生產(chǎn)控制,穩(wěn)定性試驗(yàn)安全性試驗(yàn),繼代

8、試驗(yàn),回歸試驗(yàn),,最大安全量,,帶毒（菌）和排毒（菌）試驗(yàn),同居感染,,疫苗鑒定和疫苗生產(chǎn)控制,除需規(guī)檢驗(yàn)之外的應(yīng)進(jìn)行的一些試驗(yàn)。尤其是聯(lián)毒活苗，如其純度有效性、安全性、穩(wěn)定性和免疫期等有關(guān)重要參數(shù)未做出科學(xué)的鑒定，即按入批另生產(chǎn)，并現(xiàn)場使用，后果不堪設(shè)想。 可參閱有關(guān)生物制品檢驗(yàn)的資料。,疫苗研究鑒定和生產(chǎn)控制,其他試驗(yàn),凍干試驗(yàn),保存期試驗(yàn),注射局部的病變檢測,免疫株的克隆化,最小免疫量,免疫力生產(chǎn)期,免疫期,免疫途徑,免疫性試

9、驗(yàn),,,一、穩(wěn)定性試驗(yàn) 繼代試驗(yàn)－－5—10代、不迫強(qiáng)二、安全性試驗(yàn) 最大安全量試驗(yàn) 帶毒(菌)和排菌(毒)試驗(yàn) 同居感染試驗(yàn)三、免疫性試驗(yàn) 最小免疫量試驗(yàn) 免疫力產(chǎn)生期試驗(yàn) 免疫期試驗(yàn) 免疫途徑試驗(yàn)四、其他試驗(yàn) 疫苗株的克隆化 注射局部的病變檢測 保存期試驗(yàn),疫苗的使用,免疫途徑 死苗、類毒素、亞單位苗——非口(皮下) 活苗——不受限制 口

10、服、飲水、氣霧——集約養(yǎng)禽業(yè)免疫程序： 必須據(jù)疫病流行性以及規(guī)律，畜禽的用途、年0，母源抗體水平和飼養(yǎng)條件，以及疫苗的種類、性質(zhì)、免疫途徑等方面的因素制訂，所制訂程序還需根具體情況隨時調(diào)整。母源抗體有或無監(jiān)測,免疫失敗原因,——免疫接種群體所有成預(yù)，免疫水平也不是相等的。 免疫范圍傾向于正態(tài)方布，即大部分為中等；少一很差1、正常免疫反應(yīng)受抑制——寄生蟲——營養(yǎng)——妊娠，過熱過冷 2、母源抗體 3、疫苗使用不等 4、活

11、疫苗貯存不當(dāng)，使用時已失活，活菌苗與抗菌體，化學(xué)活毒劑 付反應(yīng)： 毒性——流產(chǎn)； 過敏反應(yīng),疫苗的產(chǎn)生與發(fā)展,“疫苗”（Vaccine）這個詞在文明世界中出現(xiàn)，是偉大的法國科學(xué)家巴斯德在19世紀(jì)的貢獻(xiàn)之一，它的含義是“能避免瘟疫的物質(zhì)”。迄今為止，出現(xiàn)不過一百余年，但是它在人類歷史上創(chuàng)造的奇跡，已經(jīng)足以在現(xiàn)代文明的進(jìn)程中留下濃墨重彩的一筆。,分子生物學(xué)技術(shù)與疫苗學(xué),由于分子生物學(xué)理論及技術(shù)在免疫學(xué)領(lǐng)域內(nèi)的滲透，以往疫苗研究中的一

12、些經(jīng)驗(yàn)性質(zhì)的概念出現(xiàn)了上升到理論高度的躍進(jìn)，是人們能從推理和分析的角度來探索疫苗研制中的技術(shù)問題。利用分子生物學(xué)技術(shù)，人們可以更為細(xì)致、嚴(yán)格的分析所出現(xiàn)的病原體和存在的病原體。,疫苗研究的技術(shù)進(jìn)步,層析技術(shù)離心分離技術(shù)基因工程技術(shù)免疫學(xué)檢測技術(shù)投遞系統(tǒng)技術(shù)和佐劑實(shí)驗(yàn)動物技術(shù),層析技術(shù),凝膠排阻層析親和層析離子交換層析,實(shí)驗(yàn)動物技術(shù),毒性實(shí)驗(yàn)疫苗的效力實(shí)驗(yàn)疫苗毒力測定轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)動物和基因敲除實(shí)驗(yàn)動物的應(yīng)用,新型疫苗的

13、技術(shù)探索,百日咳無細(xì)胞疫苗的研究與應(yīng)用B型嗜血流感桿菌莢膜多糖－蛋白結(jié)合疫苗乙型肝炎基因工程疫苗,新型疫苗設(shè)計的技術(shù)基礎(chǔ),新型疫苗研制的出發(fā)點(diǎn)新型疫苗設(shè)計的基本技術(shù)條件,疫苗,活苗死苗代謝產(chǎn)物和亞單位疫苗類毒素多價苗和聯(lián)苗,活苗,強(qiáng)毒苗弱毒苗異源苗,弱毒疫苗,毒力減弱，但仍保持原來的免疫性，能在體內(nèi)一時性繁殖優(yōu)點(diǎn)：接種量少，可獲得堅強(qiáng)的免疫力，免疫期長，不須使用佐劑，但需凍干。 選有抗原性好而毒力適當(dāng)減弱的菌(毒

14、)株是弱毒疫苗的研究的關(guān)鍵。這些菌(毒)株有的是從天然弱毒中篩選的，如雞新城疫，F(xiàn)系、B系、La Sota系，但大多數(shù)是通過人工培養(yǎng)致弱的,人工培育弱毒苗的途徑,①通過不適宜的人工培養(yǎng)條件 ②在非易感動物體內(nèi)長期傳代 ③除上述生物系方法外，還可應(yīng)用物理方法，以射線，紫外線照射后通過篩選，找弱毒株，病毒弱毒株的培養(yǎng)。豬瘟兔化毒400代以后,異源苗,異源苗—是利用有共同保護(hù)性抗原的另一種病毒制作了疫苗，已知以下各組病毒有交叉免疫

15、作用。牛瘟、犬瘟熱病毒牛痘與天花,死苗,死苗—將病體用現(xiàn)代方法(溫和)使其失活，但仍保持其免疫性即為死苗(病毒)疫苗，研制同期短、3月左右、安全易保存。 但不能在體內(nèi)增殖、使用劑量大、免疫效果不如弱毒苗,死苗,滅活方法加熱法——已少用化學(xué)方法：①福馬林形成交聯(lián)，使生物失去活性。 ②烷化劑——?dú)⑺郎?，而不影響抗原性?常用乙烯亞胺、乙酰乙烯亞胺(AEI)，丙烯內(nèi)胎(PL)等。

16、佐劑：氫氧化鋁、雙相乳化法（石蠟油和span80乳化；油包水和吐溫80乳化）,,滅活方法,物理方法：加熱化學(xué)方法 ①甲醛——作用于酰氨基及核酸的非氫鍵氨基，形成交聯(lián)，使微生物失活。 ②烷化劑——使核酸鏈交聯(lián)，進(jìn)而殺死病源微生物。主要有氯化乙烯、乙烯亞胺、乙酰乙烯亞胺等,死疫苗與活疫苗的區(qū)別,類毒素,經(jīng)甲醛處理后的細(xì)菌外毒素exotoxin，失去毒性而仍保留有抗原性能刺激機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性免疫的制劑——類毒素(toxiod

17、)破傷風(fēng)，白喉,新型疫苗的研制,亞單位疫苗結(jié)合疫苗合成肽疫苗基因工程疫苗DNA疫苗轉(zhuǎn)基因植物疫苗特異化的疫苗研究,亞單位疫苗,分離提取病原體中具有免疫功能的蛋白，或利用 DNA重組技術(shù)使重組體表達(dá)這類蛋白、或多肽或合成肽制成的疫苗，這類疫苗不是完整的病毒，是病毒的一部分物質(zhì)，故稱亞單位疫苗。 去除病原體中與激發(fā)保護(hù)性免疫無關(guān)的甚至是有害的成分，保留有效免疫原成分制作的疫苗。,目前國際上已進(jìn)入臨床觀察的亞單位疫苗有,巨細(xì)胞

18、病毒（糖蛋白）、EB病毒（gp3 50）、單純皰疹病毒I、II型（g D2和 g B2）、人乳頭瘤病毒（L2 和 E7）、呼吸道合胞病毒（F蛋白）以及艾滋病疫苗（gp1 6 0、gp1 2 0）等病原體中具有免疫功能的是抗原蛋白，起決定作用的是抗原蛋白上的抗原決定簇。抗原決定簇由數(shù)量不等的抗原表位組成，T細(xì)胞表位和 B細(xì)胞表位具有免疫原性，可誘導(dǎo)體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng)。目前已有表位的亞單位疫苗，包括合成肽亞單位疫苗，如登革熱病毒、EB

19、病毒和丁肝病毒的合成肽疫苗；還包括表位融合蛋白亞單位疫苗，即：將表位與載體蛋白重組后在原核或真核細(xì)胞表達(dá)，成為融合蛋白，正在研究的疫苗有艾滋病疫苗等。,,口蹄疫，流感,結(jié)合疫苗,將細(xì)菌莢膜多糖的水解物化學(xué)聯(lián)接于白喉類毒素，為細(xì)胞莢膜多糖提供蛋白質(zhì)載體，使其成為T細(xì)胞依賴型抗原。它能引起T、B細(xì)胞的聯(lián)合識別。已獲準(zhǔn)使用的結(jié)合疫苗有B型流感桿菌疫苗、腦膜炎球菌疫苗、肺炎球菌疫苗。,合成肽疫苗,根據(jù)有效免疫原的氨基酸序列，設(shè)計合成的能激發(fā)有

20、效特異性免疫應(yīng)答的最小的免疫原性多肽。分子小、免疫原性弱、常需要交聯(lián)載體才能誘導(dǎo)免疫應(yīng)答，常用的載體是脂質(zhì)體。 目前正在研制的主要是細(xì)胞毒素、HIV 和腫瘤等的合成肽疫苗。,多肽疫苗,多肽疫苗與核酸疫苗一樣是目前疫苗研究領(lǐng)域內(nèi)較受重視的研究方面之一。尤其是對病毒多肽疫苗進(jìn)行了大量研究。目前對人類危害極大的兩種病毒性疾病艾滋病和丙型肝炎均無理想的疫苗，核酸疫苗和多肽疫苗的研究結(jié)果令人鼓舞。1999年美國NIH公布了兩種HI

21、V-I病毒多肽疫苗，對人體進(jìn)行的I期臨床試驗(yàn)結(jié)果，證實(shí)兩種多肽能刺激機(jī)體產(chǎn)生特異性抗體和特異性細(xì)胞免疫，并有較好的安全性。我國清華大學(xué)也證實(shí)HIV-I膜蛋白內(nèi)一段多肽有很強(qiáng)的免疫原性。丙肝病毒多肽疫苗也顯示有良好的發(fā)展前景，國外學(xué)者從丙肝病毒(HCV)外膜蛋白E2內(nèi)篩選出一段多肽，它可刺激機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性抗體。其它病毒(如甲肝、麻疹、辛德畢斯病毒等)的多肽疫苗及抗腫瘤、避孕等多肽疫苗的研究也取得了較大進(jìn)展。例如，美國學(xué)者NaZ等從噬菌體肽

22、庫內(nèi)篩選出一個12氨基酸小肽，它能特異性地與人卵子結(jié)合，阻止精子與卵子的結(jié)合，可用作避孕疫苗。,重組疫苗,具有應(yīng)用意義的重組及真核表達(dá)系統(tǒng)重組疫苗中的病毒載體細(xì)菌重組載體系統(tǒng),具有應(yīng)用意義的重組及真核表達(dá)系統(tǒng),全世界廣泛使用的重組疫苗是乙型肝炎病毒疫苗，其抗原是其結(jié)構(gòu)中的表面抗原，它必須在糖基化后才能表現(xiàn)出免疫原性。哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)酵母表達(dá)系統(tǒng),重組疫苗中的病毒載體,重組痘苗病毒載體脊髓灰質(zhì)炎缺陷型重組病毒載體逆轉(zhuǎn)錄病毒

23、載體昆蟲病毒載體,以病毒和細(xì)菌為活載體的活疫苗。,這方面的研究，開始于用痘苗病毒構(gòu)建重組病毒，經(jīng)過 1 0年的探索，構(gòu)建了許多重組痘苗病毒，在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)小規(guī)模試驗(yàn)表明，作為疫苗是有效的。而且，這種抗原以半復(fù)制的形式提呈給宿主，可成功地誘導(dǎo)各種類型的免疫應(yīng)答，產(chǎn)生保護(hù)性免疫。這些進(jìn)展極大地剌激了病毒活載體疫苗的研究，先后構(gòu)建了其它痘病毒、皰疹病毒、腺病毒和腸病毒的活載體……,對于構(gòu)建病毒活載體疫苗應(yīng)注意以下幾點(diǎn)：,第一是親本病毒株的選擇。

24、首先，親本病毒應(yīng)該是目前使用的疫苗株，不引起宿主發(fā)生疾病；第二，應(yīng)考慮宿主特異性，對其它動物特別是人類不會構(gòu)成威脅；第三，應(yīng)考慮保護(hù)性免疫應(yīng)答的類型，是全身性免疫應(yīng)答還是局部的粘膜免疫應(yīng)答。第二是病毒復(fù)制非必需區(qū)的克隆和篩選?；驊?yīng)插入到病毒基因組中對于病毒復(fù)制非必需的區(qū)域，因此，非必需區(qū)的克隆和篩選是病毒活載體構(gòu)建的先決條件。非必需區(qū)的克隆策略可分為兩類。一類是，病毒的分子遺傳背景比較清楚，通過結(jié)構(gòu)與功能研究已確定了一個或

25、一個以上的非必需區(qū)，此時可采用定向克隆策略快捷地獲得非必需區(qū)。一類是，如果病毒的遺傳背景不太清楚，非必需區(qū)尚未確定，則要采用隨機(jī)篩選策略，即采用鳥槍法克隆基因組片斷，通過功能性研究篩選非必需區(qū)。后一策略需要花費(fèi)大量的精力和時間。病毒基因組的非必需區(qū)有嚴(yán)格非必需和一般非必需之分，構(gòu)建病毒活載體應(yīng)選用嚴(yán)格非必需區(qū)，才能維持親本株的復(fù)制能力，這對于重組病毒的免疫效力是極其重要的。需要指出的是，某些復(fù)雜病毒的基因編碼框架常發(fā)生重疊，如果一個必

26、需基因與一個嚴(yán)格非必需基因部分重疊，插入位點(diǎn)的位置應(yīng)避開必需基因區(qū)，否則將會產(chǎn)生相反的效果。,第三是外源基因表達(dá)的調(diào)控元件,這包括啟動子、增強(qiáng)子、起始密碼和終止密碼等，其中最重要的是啟動子。此外，應(yīng)具備便于重組病毒篩選的遺傳標(biāo)記，常用的報告基因是 Lac Z。外源基因在重組病毒中的表達(dá)水平，主要受啟動子的影響：(1 )選用的啟動子應(yīng)強(qiáng)；(2 )痘病毒因自身復(fù)制的特殊性，應(yīng)選用病毒科內(nèi)的啟動子，其它病毒一般可選用其它的真核啟動子，前

27、提是可被病毒感染細(xì)胞所識別；(3 )一些復(fù)雜病毒 (如痘病毒和皰疹病毒 )的啟動子有早期和晚期之分，選用不同時期的啟動子將影響外源基因的表達(dá)時相及表達(dá)產(chǎn)量，一般采用晚期啟動子或兼有早、晚期兩種功能的啟動子；(4)一般來說，外源基因的起始密碼子距啟動子越近，外源基因的表達(dá)效果越好。這里需要指出的是，復(fù)雜病毒的基因表達(dá)調(diào)控是相互有影響的，影響啟動子功能的因素是十分復(fù)雜的，因此，一個表達(dá)系統(tǒng)中的強(qiáng)啟動子應(yīng)用于另一個系統(tǒng)，未必就是強(qiáng)啟動子,痘

28、病毒活載體,痘病毒是最大的 DNA病毒，基因組大而復(fù)雜，長約 1 80～ 3 0 0 kb。因此，用其構(gòu)建病毒活載體的最大優(yōu)點(diǎn)是容量大，有大量的非必需片段可用作插入外源基因的位點(diǎn)。痘病毒基因組 DNA不具有感染性，它在細(xì)胞中的復(fù)制是在病毒自身的酶及其獨(dú)特的調(diào)控信號作用下進(jìn)行的，這與真核細(xì)胞的基因表達(dá)調(diào)控機(jī)理不同。有別于其它 DNA病毒，痘病毒的轉(zhuǎn)錄、翻譯和裝配均發(fā)生在細(xì)胞質(zhì)中，這有利于外源基因?qū)攵徊《净蚪M中及外源表達(dá)產(chǎn)物的檢測。重

29、組痘病毒表達(dá)的蛋白存在加工、修飾及轉(zhuǎn)移過程，如糖基化和磷酸化等，以較高級的形式存在，因此抗原性變異不大。,目前已構(gòu)建的痘病毒載體,有痘苗病毒、雞痘病毒、牛痘苗病毒、豬痘病毒、羊痘病毒以及兔痘病毒活載體，其中，研究較多的是痘苗病毒和雞痘病毒活載體。目前已構(gòu)建的痘病毒載體，有痘苗病毒、雞痘病毒、牛痘苗病毒、豬痘病毒、羊痘病毒以及兔痘病毒活載體，其中，研究較多的是痘苗病毒和雞痘病毒活載體。,,痘苗病毒活載體的研究開始于很久以前了，現(xiàn)在已有許

30、多重組痘病毒株被構(gòu)建，表達(dá)的外源基因有真核基因 (如人 IL-2、牛 r干擾素基因 )、原核基因 (如Lac Z和 CAT基因 )，以及許多種病毒的免疫原基因。,,由于痘病毒基因組龐大，不便在體外進(jìn)行直接操作，而且基因組 DNA沒有感染性，因此，重組痘病毒的構(gòu)建必須分兩步進(jìn)行，外源基因不能直接插入到病毒基因組中。首先是構(gòu)建一個重組質(zhì)粒，又叫轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒。此質(zhì)粒應(yīng)帶痘病毒的啟動子，其下游接外源基因，在它們的兩側(cè)為痘病毒特異的 DNA序列。

31、然后是將此質(zhì)粒導(dǎo)入痘病毒感染的細(xì)胞中，痘病毒DNA與質(zhì)粒中的同源序列在細(xì)胞內(nèi)可發(fā)生同源重組，由此將外源基因組裝到痘病毒基因組的特定部位，構(gòu)建出重組的痘病毒,重組痘病毒篩選方法可分為兩類系統(tǒng)。,在痘苗病毒，利用病毒本身的胸苷激酶(TK)基因作為選擇標(biāo)記，是較常用的方法：用 TK+痘苗病毒感染表型為 TK-的細(xì)胞后 1～ 2小時，采用由痘苗病毒 TK基因構(gòu)建的轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染該細(xì)胞，在受染細(xì)胞發(fā)生 TK基因同源重組而形成 TK-并帶有外源基

32、因的重組痘苗病毒 ;在培養(yǎng)液中加入5-溴尿嘧淀脫氧核苷 (Bud R)，TK+病毒不能存活，只有 TK-重組病毒能增殖并形成蝕斑 ;將病毒蝕斑挑出，用核酸探針檢測重組病毒是否帶有外源基因。這些篩選系統(tǒng)的局限是，只能用 TK基因作為非必需片段構(gòu)建重組病毒；另外，需有一株適合病毒生長并能產(chǎn)生蝕斑的 TK-細(xì)胞系。最常采用的篩選系統(tǒng)是另一類，包括細(xì)菌β-半乳糖苷酶(Lac Z)基因，新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶 (Neo)基因等。用這類篩選標(biāo)記，在構(gòu)建

33、轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒時需將標(biāo)記基因盒連同外源基因一同插入非必需片段：例如將 Lac Z基因與外源基因共表達(dá)，Lac Z與其底物 X-gal呈藍(lán)色反應(yīng)，這樣在含有 X-gal的培養(yǎng)基中可方便地挑選出藍(lán)色的重組痘病毒；如將 Neo基因在外源基因共表達(dá)，Neo可使宿主細(xì)胞對抗生素G418產(chǎn)生抗性，在含G418的培養(yǎng)液中可挑選到重組痘病毒。,重組雞痘病毒的研究取得的進(jìn)展,用雞痘病毒為活載體，已成功地表達(dá)了馬立克氏病毒、禽流感病毒 1 1 5和 1 1

34、7亞型、傳染性法氏囊病毒、新城疫病毒、狂犬病病毒以及麻診病毒的免疫原基因。將這些雞痘活載體表達(dá)疫苗接種動物進(jìn)行免疫試驗(yàn)，取得了不同程度的免疫保護(hù)效果，其中，表達(dá)馬立克氏病毒 g B基因的雞痘病毒活載體疫苗免疫效果最佳，免疫雞用強(qiáng)毒株攻擊 1 0 0 %不發(fā)病，用超強(qiáng)毒株攻擊 90 %不發(fā)病。哈爾濱獸研所也在進(jìn)行這方面的研究，目前已構(gòu)建了表達(dá)傳染性法氏囊病毒 VP2 基因的重組雞痘病毒。與痘苗病毒不同，雞痘病毒的宿主范圍很窄，不感染哺乳動

35、物，因此，重組雞痘病毒疫苗的使用不會因水平傳播而對人類或其它動物構(gòu)成威脅，具有廣闊的應(yīng)用前景。,皰疹病毒活載體,幾乎所有哺乳動物都存在皰疹病毒，某些動物皰疹病毒對畜牧業(yè)構(gòu)成嚴(yán)重危害，如偽狂犬病病毒。同痘病毒一樣，皰疹病毒的基因組較大，約 1 50 kb左右，預(yù)計含有約 70個編碼基因，其中至少有 2 0 %的基因是非必需基因，可容納多個外源基因的插入。大多數(shù)皰疹病毒 (偽狂犬病病毒除外 )的宿主范圍很窄，其重組病毒的使用不會產(chǎn)生流行病

36、學(xué)方面的不良后果。 。某些動物皰疹病毒對畜牧業(yè)構(gòu)成嚴(yán)重的危害，如偽狂犬病病毒。許多皰疹病毒經(jīng)粘膜途徑感染，構(gòu)建的載體活疫苗可經(jīng)粘膜途徑提呈抗原，誘導(dǎo)特異性粘膜免疫,皰疹病毒活載體的構(gòu)建及篩選方法,與痘病毒相似，它的核酸具有感染性，通常采用轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒與全病毒 DNA共轉(zhuǎn)染的方法構(gòu)建重組病毒。皰疹病毒在細(xì)胞核中復(fù)制，與痘病毒不同，其復(fù)制利用細(xì)胞的酶系統(tǒng)，許多真核啟動子 (如 SV40的啟動子 )可啟動外源基因在皰疹病毒感染細(xì)胞中的表達(dá)

37、，因此可供選擇的啟動子較多。篩選方法上，如有可為活載體表達(dá)外源基因作為疫苗的研究，主要有單純皰疹病毒、偽狂犬病病毒、火雞皰疹病毒、牛皰疹病毒 和馬皰疹病毒 ?；痣u皰疹病毒活載體，是禽病毒基因工程研究中比較活躍的領(lǐng)域。最成功的例子是，用病毒基因組Us區(qū)中單純皰疹病毒 US2同源的區(qū)段插入新城疫病毒的 F和 HN基因，由此構(gòu)建的重組病毒，接種雞后可抵抗新城疫病毒和馬立克氏病病毒強(qiáng)毒株的攻擊。用該病毒載體表達(dá)馬立克氏病毒 g B基因是

38、一個研究熱點(diǎn)，主要目標(biāo)是解決馬立克氏病弱毒疫苗不能凍干而給保存、運(yùn)輸和使用帶來的問題。國外和哈爾濱獸研所正在進(jìn)行這方面的研究。,其它病毒活載體,在人類和動物群體中，腺病毒隨處可見，有多種血清型，多數(shù)腺病毒感染癥狀較輕或呈隱性感染。與痘病毒和皰疹病毒相比，腺病毒基因組要小得多，約30～50kb，因此對外源基因的容量很小，只能表達(dá) 1～ 2個中等大小的基因。腺病毒載體有獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)：(1 )腺病毒對熱不敏感，在適合的培養(yǎng)系統(tǒng)中呈高滴度增殖

39、，因此腺病毒活載體疫苗的成本低；(2 )腺病毒能誘導(dǎo)粘膜免疫，特別是能制成藥囊經(jīng)口服途徑接種以預(yù)防消化道及呼吸道感染。脊髓灰質(zhì)炎病毒活載體的優(yōu)點(diǎn)是，可經(jīng)口服途徑產(chǎn)生胃腸道粘膜免疫。因基因組小，對外源基因的容量不大。用 RNA病毒構(gòu)建載體的前提是，需先構(gòu)建病毒 RNA基因組的感染性 c DNA分子克隆，這項工作的難度較大。反轉(zhuǎn)錄病毒生活周期的一個重要階段，是將病毒 RNA反轉(zhuǎn)錄為前病毒DNA并整合到宿主細(xì)胞的染色體中，因此，同其它RN

40、A病毒相比，構(gòu)建感染性前病毒分子克隆相對容易一些。反轉(zhuǎn)錄病毒的基因組很小 (8～ 1 0 kb)，只存在很小的非必需區(qū)，因此對外源基因的容量很小。反轉(zhuǎn)錄病毒載體作為將外源基因?qū)塍w細(xì)胞的工具，在人類遺傳疾病的基因治療方面得到了廣泛的應(yīng)用。近年來，也有研究采用反轉(zhuǎn)錄病毒構(gòu)建載體疫苗。例如，用勞斯肉瘤病毒構(gòu)建載體表達(dá)禽流感病毒的血凝素 (H7)基因，免疫雞用強(qiáng)毒株 H7N7攻擊后完全獲得保護(hù)；但是，表達(dá)核蛋白 (NP)的活載體疫苗，接種雞

41、后不能抵抗強(qiáng)毒株的攻擊。,病毒活載體疫苗具有長遠(yuǎn)的開發(fā)前景。,(1)生產(chǎn)成本和接種使用成本低，類似于常規(guī)弱毒疫苗；(2 )能真實(shí)地再現(xiàn)外源基因編碼蛋白的抗原性，并能全方位地激發(fā)免疫應(yīng)答，包括細(xì)胞介導(dǎo)免疫、體液免疫以及局部粘膜免疫；(3 )提呈免疫原的單一性類似亞單位疫苗，但不需要佐劑，如果載體病毒是安全的，則不會引起疾??；(4)免疫接種和自然感染動物，用特異性診斷試劑可進(jìn)行鑒別；(5) 最重要的，在同一病毒載體中插入多種免疫原基

42、因，可構(gòu)建多價疫苗。簡言之，病毒活載體疫苗兼有常規(guī)活疫苗和滅活疫苗的優(yōu)點(diǎn)，它具備活疫苗的免疫效力和低成本、滅活疫苗的安全性,病毒活載體疫苗的最大缺點(diǎn),使用同一載體的不同疫苗不能同時使用。解決這一難題的辦法是：(1 )構(gòu)建多價疫苗，一次接種預(yù)防多種疾?。?2 )構(gòu)建多種可用的載體；(3 )建立合理的免疫程序，將弱毒疫苗、滅活疫苗以及病毒活載體疫苗配合作用。,病毒疫苗的展望,病毒疫苗的研究是一個漫長的過程，目前病毒活載體疫苗在構(gòu)建方

43、法上已日趨成熟，沒有不可跨越的技術(shù)障礙。病毒分子生物學(xué)的飛速發(fā)展，為這方面的研究建立了豐富的理論基礎(chǔ)，提供了可靠的材料 (如非必需基因、啟動子和目的基因等 )保證。仍然存在不足之處，滅活疫苗和亞單位疫苗只能誘發(fā)體液免疫，減毒疫苗雖能誘發(fā)全面的免疫，但存在毒力回復(fù)的危險性；核酸疫苗兼具亞單位疫苗的安全性及減毒活疫苗的有效性。但核酸疫苗也存在整合到宿主染色體、致突變、產(chǎn)生抗 DNA抗體等危險性，雖然目前尚未發(fā)現(xiàn)這些問題，但其安全性有待進(jìn)一

44、步觀察?？傊?，病毒疫苗的研究取得了一些可喜的進(jìn)展，隨著人們對病毒致病原認(rèn)識的不斷深入，研制的病毒疫苗也在不斷完善。,細(xì)菌重組載體系統(tǒng),沙門氏菌載體——gal E基因缺失，脂多糖合成能力下降，誘導(dǎo)黏膜免疫反應(yīng)。缺點(diǎn)是蛋白降解酶系統(tǒng)對外源蛋白的影響?？ń槊巛d體——安全，誘導(dǎo)較強(qiáng)的細(xì)胞免疫能力。缺點(diǎn)是外源基因產(chǎn)生抗原的免疫應(yīng)答受到機(jī)體對卡介苗免疫應(yīng)答的影響。,基因免疫(gene vaccination)又稱核酸免疫(nudeic acid

45、 vaccination)或DNA免疫(DNA vaccination)，,是將可表達(dá)保護(hù)性免疫蠶的基因的質(zhì)粒DNA直接導(dǎo)入動物體細(xì)胞，使抗原蛋白經(jīng)過內(nèi)源性表達(dá)并提呈給免疫系統(tǒng)，激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生特異性的體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)，形成對相應(yīng)病原的免疫保護(hù)作用。以達(dá)到預(yù)防和治療疾病的目的。 用于免疫注射的質(zhì)粒DNA稱為核酸疫苗(nudeic acid vaccine)基因疫苗(gene vaccin)式DNA疫苗(DNA Vaccine)。,核酸疫

46、苗由來源于病原體的一個抗原編碼基因和作為載體的質(zhì)粒 DNA組成。將攜帶流感病毒核心蛋白編碼的質(zhì)粒注入小鼠肌肉，產(chǎn)生了對流感病毒的保護(hù)，從而開辟了疫苗學(xué)的一個嶄新領(lǐng)域。當(dāng)前在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究的有巨細(xì)胞病毒、乙肝、丙肝、流感、輪狀病毒和艾滋病等核酸疫苗，其中乙型肝炎和艾滋病等核酸疫苗已進(jìn)入 期臨床觀察。,核酸疫苗是一個新生事物，圍繞著增強(qiáng)核酸疫苗的免疫效果和安全性、改善純化工藝等國際熱點(diǎn)問題，在理論上還沒有真正尋找到理想的解決途徑，從而大大限

47、制了核酸疫苗的推廣應(yīng)用，這些問題包括 :(1)核酸疫苗的免疫機(jī)制尚不太清楚；（2）核酸疫苗的免疫效果在不同動物個體中差異較大，有些疫苗在小個體的動物中免疫和保護(hù)效果較好，而在大個體動物中效果較差，確切原因尚不清楚；（3）核酸疫苗畢竟是一種基因疫苗，其安全性尚需全面、長期觀察；（4）核酸疫苗的大量制備、純化工藝中尚存在許多理論上較難解決的問題,核酸免疫,DNA疫苗的免疫學(xué)理論基礎(chǔ)DNA疫苗的具體工作原理,DNA疫苗研制的基本技術(shù)

48、,研制及效果觀測的技術(shù)步驟質(zhì)粒構(gòu)建的基本技術(shù)要求導(dǎo)入體內(nèi)的技術(shù)要求大規(guī)模制備的技術(shù)要求,,研制及效果觀測的技術(shù)步驟,靶抗原基因的分析與選擇疫苗質(zhì)粒的構(gòu)建疫苗質(zhì)粒的制備體外預(yù)試驗(yàn)試驗(yàn)動物的選擇免疫途徑及DNA質(zhì)粒導(dǎo)入的效率分析免疫療程的研究免疫反應(yīng)及免疫保護(hù)性的測定與評價其他指標(biāo)及安全性分析,導(dǎo)入體內(nèi)的技術(shù)要求,注射法局部直接吸收法基因槍導(dǎo)入法脂質(zhì)體導(dǎo)入法微囊導(dǎo)入法,DNA疫苗的免疫學(xué)分析,細(xì)胞免疫反應(yīng)體液

49、免疫反應(yīng)免疫記憶誘導(dǎo)免疫反應(yīng)能力的改進(jìn),細(xì)胞免疫反應(yīng),DNA疫苗可以直接影響誘導(dǎo)CD4+和CD8＋ T輔助細(xì)胞反應(yīng)。只有再攻擊后才表現(xiàn)出CTL反應(yīng)，并且有較強(qiáng)的特異性，并呈現(xiàn)相應(yīng)的免疫保護(hù)性。,體液免疫反應(yīng),DNA疫苗能增強(qiáng)Th1細(xì)胞素的產(chǎn)生能力，又有誘導(dǎo)中和抗體產(chǎn)生的能力，其抗體反應(yīng)相似于自然條件下的免疫反應(yīng)，再加上其本身的優(yōu)點(diǎn)，它具有優(yōu)于傳統(tǒng)蛋白疫苗和重組多肽疫苗的特點(diǎn)。,誘導(dǎo)免疫反應(yīng)能力的改進(jìn),促進(jìn)DNA疫苗抗原在MHC I類

50、分子的抗原遞呈途徑中起作用。使用多抗原表位基因結(jié)構(gòu)取代單一結(jié)構(gòu)蛋白基因形成DNA疫苗。使用某些細(xì)胞素佐劑和DNA共刺激。,DNA疫苗的安全性問題,DNA疫苗質(zhì)粒中的外源基因整合進(jìn)入染色體基因的可能性DNA疫苗可能引起的自身免疫性反應(yīng),近期有希望實(shí)用的DNA疫苗,瘧原蟲DNA疫苗HIV DNA疫苗乙型肝炎病毒DNA疫苗,番 茄,馬鈴薯,香 蕉,多價苗和聯(lián)苗,多價苗：指由同一種微生物中若干血清型菌(毒)株的增殖培養(yǎng)物制備

51、的疫苗。它是以生物操作的方法，使多肽或DNA疫苗在基因結(jié)構(gòu)上已形成一個連接體而制成的，能使免疫動物獲得完全的保護(hù)(如豬多價副傷寒死菌苗)。聯(lián)苗：將兩種或兩種以上的疫苗抗原各自完成半成品制備后，根據(jù)免疫學(xué)分析而確定的最佳組合方式，利用物理方法制備的疫苗混和制劑。它混合制成二聯(lián)苗、三聯(lián)苗，甚至多聯(lián)苗，用于預(yù)防畜禽的傳染病。,聯(lián)苗,目前生產(chǎn)的聯(lián)苗有：雞新城疫－雞傳染性支氣管炎二聯(lián)活疫苗、雞傳染性鼻炎－雞新城疫二聯(lián)滅活疫苗、雞新城疫－雞傳染性

52、支氣管炎-雞痘三聯(lián)活疫苗、豬瘟-豬丹毒-豬肺疫三聯(lián)活疫苗、豬丹毒－豬巴氏桿菌病二聯(lián)滅活疫苗、羊快疫－猝狙（或羔羊痢疾）－腸毒血癥三聯(lián)滅活疫苗等。聯(lián)苗應(yīng)用的特點(diǎn)為（1）使生產(chǎn)工藝簡單化。（2）減少了注射次數(shù)。一次注射可獲得兩個或兩個以上的特異性抗體。（3）操作更為簡便快速。 （4）節(jié)約工時和原材料。 但由于不同的疫苗其產(chǎn)生的免疫期限不同，所以在進(jìn)行一次多聯(lián)苗注射后，要根據(jù)其各自疫苗的不同免疫期限，再進(jìn)行單價苗的免