多表位重組抗原的研制及在日本血吸蟲病診斷和免疫預(yù)防上的初步應(yīng)用.pdf

1、日本血吸蟲病(schistosomiasis)仍然是我國重要的公共衛(wèi)生問題之一。病牛是我國血吸蟲病最重要的傳染源，在某些流行區(qū)內(nèi)羊在血吸蟲病傳播中的作用也不可忽視，有效控制牛、羊血吸蟲病對我國早日阻斷血吸蟲病傳播將有重大的意義。診斷是血吸蟲病防控中的中心環(huán)節(jié)。在現(xiàn)已建立的各種血清學(xué)診斷技術(shù)中，血吸蟲蟲卵可溶性抗原SEA是最常用的診斷抗原，但以SEA作為診斷抗原，往往特異性較差，交叉反應(yīng)高，不能區(qū)分現(xiàn)癥感染和既往感染以及不能作為療效考核的

2、診斷抗原。一些血吸蟲重組抗原已被用作診斷抗原或疫苗候選分子，評估其應(yīng)用前景，但大多數(shù)重組抗原獲得的敏感性都低于SEA，誘導(dǎo)的保護(hù)效果都不夠高或不穩(wěn)定。多表位重組抗原含有多個抗原表位有可能增強(qiáng)其抗原性和免疫原性，把它們作為診斷抗原或疫苗候選分子，有可能提高診斷方法的敏感性和疫苗的免疫保護(hù)效果。基于此，本文開展了以下幾個方面的研究:
　　1.候選抗原SjPGM和SjRAD23細(xì)胞表位的分析及單分子和多表位重組抗原的構(gòu)建
　　應(yīng)用

3、BepiPred1.0、T-epitope Designer、PredictProtein、IEDB Analysis等在線預(yù)測軟件預(yù)測候選抗原SjPGM和SjRAD23的B細(xì)胞和T細(xì)胞表位及候選抗原肽段的抗原性、可接近性等，綜合各個預(yù)測軟件的分析結(jié)果，篩選出表位富集肽段三段，包括從SjPGM挑選出的BSjPGM(aa85-166);SjRAD23挑選出的BSjRAD23-1(aa46-123)和BSjRAD23-2(aa166-230

4、)。另Sj23抗原的大親水區(qū)(LHD-Sj23)也被引入作為候選表位富集肽段。設(shè)計(jì)特異性引物，共構(gòu)建了9種重組原核表達(dá)質(zhì)粒，其中包括4種單分子重組表達(dá)質(zhì)粒:BSjPGM/pET-28a(+)、BSjRAD23-1/pET-28a㈩、BSjRAD23-2/pET-28a(+)、BSj23/pET-32a(+)和5種多表位重組表達(dá)質(zhì)粒:BSjPGM-BSj23/pET-28a(+)、BSjPGM-BSjRAD23-1/pET-28a(+)、

5、BSjPGM-BSjRAD23-1-BSj23/pET-28a(+)、BSj RAD23-2-BSjPGM-BSj23/pET-28a(+)和BSj RAD23-2-BSjPGM/pET-28a(+)。除BSjPGM/pET-28a(+)、BSjRAD23-2/pET-28a(+)、BSjRAD23-2-BSjPGM/pET-28a(+)外，其余6種重組表達(dá)質(zhì)粒均成功在大腸桿菌中表達(dá)，并經(jīng)純化獲得條帶單一的目的蛋白。
　　2.單分

6、子/多表位重組抗原用于診斷山羊血吸蟲病的初步研究
　　以重組抗原rSjPGM和rSjRAD23及新構(gòu)建的6種表位重組蛋白作為診斷抗原，以SEA作為參照抗原，應(yīng)用間接ELISA方法檢測山羊日本血吸蟲病，共檢測91份山羊感染日本血吸蟲血清，44份健康山羊血清，12份捻轉(zhuǎn)血矛線蟲感染血清及37份東畢吸蟲感染血清。結(jié)果顯示，除rBSjPGM-BSjRAD23-1外，其余3種多表位重組抗原獲得的敏感性都高于4種單分子重組抗原(rSjRAD2

7、3，rSjPGM，rBSjRAD23-1，rBSj23)，其中多表位重組抗原rBSjPGM-BSj RAD23-1-BSj23獲得最高的敏感性(97.8％，89/91)，且保持良好的特異性（100％，44/44）和較低的交叉反應(yīng)性（捻轉(zhuǎn)血矛線蟲:8.33％，1/12;東畢吸蟲13.51％，5/37）。而以SEA作為診斷抗原，其敏感性為100％(91/91)，但特異性僅為75％(33/44)，且與捻轉(zhuǎn)血矛線蟲和東畢吸蟲分別有25％(3/1

8、2)和83.78％(31/37)的交叉反應(yīng)。本研究結(jié)果顯示，多表位重組抗原的研制與應(yīng)用有可能提高重組抗原檢測山羊血吸蟲病的敏感性，多表位重組抗原rBSjPGM-BSj RAD23-1-BSj23有可能是一種診斷山羊血吸蟲病的優(yōu)選抗原。
　　3.單分子/多表位重組抗原用于診斷水牛血吸蟲病的效果評估
　　將在診斷山羊血吸蟲病中顯示出較好效果的5種重組表位抗原，包括2種單分子表位抗原（rBSjRAD23-1，rBSj23）和3種多

9、表位重組抗原(rBSjPGM-BSj23、rBSjP GM-BSjRAD23-1-BSj23、rBSj RAD23-2-BSjPGM-BSj23)，用于診斷水牛血吸蟲病，同樣以SEA作為參照抗原。共檢測114份日本血吸蟲感染水牛血清，92份健康水牛血清，14份前后盤吸蟲感染血清。ELISA結(jié)果顯示，5種重組表位抗原中rBSjPGM-BSjRAD23-1-BSj23獲得最高的敏感性(95.61％，109/114)，其特異性和交叉反應(yīng)率分別

10、為97.83％(90/92)和7.14(2/14)。而以SEA作為診斷抗原，獲得的敏感性為100％，特異性和交叉反應(yīng)率分別為82.61％(76/92)和50％(7/14)。本研究結(jié)果顯示，多表位重組抗原的研制與應(yīng)用可以提高重組抗原檢測水牛血吸蟲病的敏感性。同樣，多表位重組抗原rBSjPGM-BSjRAD23-1-BSj23是水牛血吸蟲病的優(yōu)選診斷抗原。
　　4.表位重組抗原誘導(dǎo)免疫保護(hù)效果的初步評價
　　在抗原表位分析基礎(chǔ)上

11、，本研究構(gòu)建了一重組表達(dá)質(zhì)粒BSjRAD23-2-BSjPGM-BSjRAD23-1/pET-28a(+)，將三種重組表位抗原rBSjRAD23-1, rBSjPGM-BSjRAD23-1, rBSjRAD23-2-BSjPGM-BSjRAD23-1結(jié)合206佐劑免疫小鼠，結(jié)果在兩批獨(dú)立的動物實(shí)驗(yàn)中，rBSj RAD23-2-BSjPGM-BSj RAD23-1在小鼠中誘導(dǎo)的減蟲率(42.7％，30.4％)和減卵率(40.3％，30.3