隱孢子蟲病免疫學診斷方法的建立和應用及其免疫預防研究.pdf

1、作為腹瀉病常見病原之一的隱孢子蟲（Cryptosporidium spp.）能侵入人或動物的腸道，引起隱孢子蟲?。╟ryptosporidiosis）。在隱孢子蟲的眾多種類中，微小隱孢子蟲（Cryptosporidiumparvum）是最常見且危害最大的。對免疫功能發(fā)育不全或缺陷的宿主，隱孢子蟲會造成嚴重的傷害，甚至會威脅生命。目前，隱孢子蟲病防控研究面臨著缺乏敏感、特異、便捷的診斷技術和有效的治療、免疫預防方法。因而，篩選免疫原性好、

2、免疫反應性高的隱孢子蟲抗原分子，研制敏感、特異的診斷技術和高保護效果的預防疫苗是當前隱孢子蟲病研究的關鍵和重要方向。
　　本研究以重組微小隱孢子蟲CP15/60（rCP15/60）和類鈣調蛋白(rCML)為抗原，建立了2個隱孢子蟲病間接ELISA診斷方法，并與nested PCR方法進行了比較;利用建立的方法，對從上海地區(qū)3個屠宰場采集的豬田間血清進行了檢測。結果顯示，兩種重組蛋白的最適包被濃度均為2μg/mL，一抗血清的最佳稀釋

3、度均為1∶100，酶標二抗的最佳稀釋度也均為1∶800。與nested PCR法檢測結果比較，rCP15/60-ELISA的陽性和陰性符合率分別為100.0％和80.0％; rCML-ELISA的陽性和陰性符合率分別為66.7％和60.0％。利用2種方法分別對291份田間樣品進行檢測，結果rCP15/60-ELISA法檢測的陽性率為59.5％，rCML-ELISA法的陽性率為51.5％，前者比后者更敏感。交叉試驗結果顯示，2種方法對豬附

4、紅細胞體感染豬血清、弓形蟲感染豬血清、豬瘟病毒感染豬血清、豬藍耳病毒感染豬血清的檢測結果均為陰性。利用rCP15/60-ELISA方法對341份豬田間樣品進行檢測，結果陽性率為56.89％;利用rCML-ELISA方法對353份豬田間樣品進行檢測，陽性率為44.47％，提示這2種ELISA方法的敏感性較高、特異性較強，可用于實驗室初篩和隱孢子蟲病的流行病學調查。
　　為了觀察CP15/60、CML2種抗原制備的疫苗對小鼠隱孢子蟲病

5、的免疫預防效果，并與其它部分抗原進行比較，將重組蛋白rCP15/60、rCML，以及rCpT全、rCpTm、rENO、rP23四個重組蛋白分別與弗氏佐劑充分乳化，通過多次皮下注射的方式免疫小鼠，觀察其體液免疫和細胞免疫應答反應;同時，對小鼠進行泰澤隱孢子蟲卵囊人工感染，觀察免疫小鼠的排卵囊情況。結果顯示，6個亞單位疫苗免疫試驗組小鼠血清IgG抗體水平、TNF和IL-5細胞因子、脾臟CD4+和CD8+含量都有不同程度提高，說明6組亞單位疫

6、苗都特異性地誘導產(chǎn)生了體液免疫和細胞免疫反應。人工感染試驗結果顯示，rCP15/60免疫組的減卵囊率達45.57％，僅次于rENO免疫組，高于其它各組;rCML免疫組的減卵囊率達34.08％，次于rENO免疫組，與rP23免疫組基本相當，但高于rCpTm和rCpT全免疫組。上述結果表明，利用rCP15/60和rCML制備的亞單位疫苗對小鼠泰澤隱孢子蟲感染均有較好的免疫保護效果，能誘導宿主產(chǎn)生了顯著的體液和細胞免疫反應，是隱孢子蟲病預防疫