硫酸鋅提高釀酒酵母乙酸耐性的機(jī)理及關(guān)鍵基因功能分析.pdf

1、乙酸是木質(zhì)纖維素水解液中主要的抑制物，同時(shí)也是乙醇發(fā)酵的副產(chǎn)物之一。高濃度乙酸抑制釀酒酵母生長(zhǎng)和代謝，降低發(fā)酵效率，產(chǎn)生氧化脅迫，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)蛋白、DNA和細(xì)胞膜等受到氧化損傷。因此，在乙醇發(fā)酵過(guò)程中，提高釀酒酵母菌株對(duì)乙酸的耐受性，是解決纖維素乙醇生產(chǎn)效率的關(guān)鍵，對(duì)纖維素乙醇發(fā)酵生產(chǎn)具有重要意義。在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加適量的硫酸鋅能夠提高釀酒酵母乙酸脅迫條件下的細(xì)胞活性和乙醇發(fā)酵效率，因此釀酒酵母鋅狀態(tài)對(duì)酵母菌環(huán)境脅迫耐性具有重要影響。但是

2、，添加適量的硫酸鋅提高釀酒酵母乙酸耐受性的分子機(jī)理目前還不清楚。
　　為了研究硫酸鋅對(duì)釀酒酵母乙酸脅迫條件下的保護(hù)機(jī)制，本文研究了在10 g/L乙酸脅迫條件下，絮凝酵母SPSC01在添加0.03 g/L的硫酸鋅實(shí)驗(yàn)組和無(wú)添加的對(duì)照組對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期全局基因轉(zhuǎn)錄和蛋白差異表達(dá)情況。分析發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)錄水平分析發(fā)現(xiàn)有212個(gè)基因發(fā)生明顯的變化，其中50個(gè)基因轉(zhuǎn)錄水平明顯上調(diào)，162個(gè)基因轉(zhuǎn)錄水平明顯下調(diào)，蛋白組數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，表達(dá)量明顯變化的蛋白

3、為116個(gè)，其中上調(diào)表達(dá)的為54個(gè)，下調(diào)表達(dá)的為62個(gè)，表達(dá)有差異的基因和蛋白涉及的細(xì)胞內(nèi)代謝途徑包括能量代謝、糖代謝、甲硫氨酸合成和維生素合成等，此外，還包括脅迫響應(yīng)相關(guān)的基因和蛋白。組學(xué)比較分析發(fā)現(xiàn)，只有28個(gè)基因在轉(zhuǎn)錄組和蛋白組中都發(fā)生變化，提示硫酸鋅對(duì)細(xì)胞基因表達(dá)的影響存在轉(zhuǎn)錄后和翻譯后修飾。在乙酸脅迫條件下，硫酸鋅能引起釀酒酵母細(xì)胞全局基因和蛋白表達(dá)的變化，進(jìn)而對(duì)酵母細(xì)胞起到氧化脅迫保護(hù)作用。此外，硫酸鋅添加的細(xì)胞甲硫氨酸和脂

4、肪酸合成途徑基因表達(dá)上調(diào)，中心碳代謝相關(guān)蛋白也出現(xiàn)差異性表達(dá)，提示硫酸鋅添加可從抵抗氧化脅迫、改變細(xì)胞能量代謝等不同機(jī)制提高釀酒酵母的乙酸耐性。
　　對(duì)轉(zhuǎn)錄組和蛋白組結(jié)果中上調(diào)表達(dá)明顯的基因，包括PET18、SAM2、RNY1、YIL002W-A進(jìn)行了進(jìn)一步研究，在釀酒酵母中過(guò)表達(dá)這些基因，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，YIL002W-A和RNY1基因過(guò)表達(dá)后能提高釀酒酵母乙酸耐受性。進(jìn)一步對(duì)未知功能基因YIL002W-A進(jìn)行了深入研究，在野生型酵母

5、染色體YIL002W-A編碼區(qū)終止密碼前插入綠色熒光蛋白基因作為報(bào)告基因，檢測(cè)乙酸脅迫條件下該基因表達(dá)，證明該基因是乙酸脅迫響應(yīng)基因，對(duì)該基因啟動(dòng)子區(qū)脅迫相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子 Yap1p和Stb5p的可能結(jié)合位點(diǎn)分別進(jìn)行突變，進(jìn)而檢測(cè)該基因表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)結(jié)合位點(diǎn)突變后，YIL002W-A基因表達(dá)下降，說(shuō)明該基因表達(dá)受到這兩個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子調(diào)控。對(duì) YIL002W-A基因敲除突變體和野生型對(duì)照菌株進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組分析，發(fā)現(xiàn)敲除 YIL002W-A基因后