SPT3定向進(jìn)化提高釀酒酵母乙醇耐性的研究.pdf

1、釀酒酵母的乙醇耐性是選育發(fā)酵生產(chǎn)燃料乙醇菌種的重要指標(biāo)，提高釀酒酵母的乙醇耐受性，對(duì)于燃料乙醇的發(fā)酵生產(chǎn)，尤其是超高濃度乙醇發(fā)酵具有重要意義。然而酵母菌的乙醇耐性受多基因調(diào)控，難以通過(guò)單基因操作得到有效改善。前人利用全局轉(zhuǎn)錄工程對(duì)釀酒酵母轉(zhuǎn)錄復(fù)合體TFIID成分SPT15編碼基因的代謝工程操作，獲得了乙醇耐性明顯提高的釀酒酵母突變體。分析表明，SPT15突變蛋白與SAGA復(fù)合體成分SPT3相互作用的改變可能是酵母突變體乙醇耐性提高的原因

2、。本文研究了釀酒酵母SPT3的定向進(jìn)化對(duì)酵母細(xì)胞乙醇耐性的影響。首先以pYES2.0載體為基礎(chǔ)構(gòu)建了SPT3組成型表達(dá)載體，通過(guò)易錯(cuò)PCR建立了SPT3突變基因文庫(kù)，并轉(zhuǎn)化釀酒酵母ATCC4126。從突變酵母轉(zhuǎn)化子中篩選到乙醇耐性提高的釀酒酵母突變株M25，在10％乙醇中培養(yǎng)36h時(shí)OD600為對(duì)照株的2.6倍，最大菌體濃度為對(duì)照株的1.2倍，而在無(wú)乙醇培養(yǎng)基中生長(zhǎng)速率沒(méi)有明顯改變；利用125g/L的葡萄糖發(fā)酵時(shí)，M25突變株的終點(diǎn)乙醇

3、濃度比對(duì)照株提高了12.5％。對(duì)M25突變株的SPT3氨基酸序列分析表明，突變蛋白與TBP結(jié)合的N端保守區(qū)59位異亮氨酸突變?yōu)樘K氨酸，推測(cè)可能與其乙醇耐性提高有關(guān)。乙醇耐性降低的兩株突變體M1和M2在無(wú)乙醇培養(yǎng)基中生長(zhǎng)速率也有所下降，突變株M1的SPT3蛋白C端縮短了85個(gè)氨基酸，M2中C端保守區(qū)的249位丙氨酸、320位色氨酸發(fā)生突變。過(guò)量表達(dá)SPT3的酵母轉(zhuǎn)化子，其乙醇耐性、生長(zhǎng)速率和發(fā)酵速率與對(duì)照株相比均沒(méi)有明顯改變。 本