鵪鶉Leptin及其受體基因的克隆及功能研究.pdf

1、自1998年“雞Leptin基因”被首次報(bào)道以來，雞Leptin基因序列的正確性，甚至Leptin是否在家禽中存在就一直備受爭(zhēng)議。雖然家禽中Leptin受體（LEPR）的存在被廣泛證實(shí)，但對(duì)其功能的研究卻由于內(nèi)源性Leptin的缺乏而受到限制。直到2014年，野生鳥類Leptin基因的成功克隆，部分回答了禽類中是否存在Leptin基因這一長(zhǎng)久困擾禽類Leptin/LEPR研究的問題，克服了禽類Leptin/LEPR研究的瓶頸。自此，Le

2、ptin/LEPR在禽類尤其是家禽中的克隆和功能研究成為目前研究的熱點(diǎn)。本研究在公開數(shù)據(jù)庫序列搜索和分析的基礎(chǔ)上，首先對(duì)鵪鶉Leptin及其受體LEPR基因進(jìn)行克隆和結(jié)構(gòu)分析，并采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法對(duì)其組織表達(dá)模式進(jìn)行研究；以3周齡（未開產(chǎn)）和20周齡（高產(chǎn)期）的朝鮮龍城黃羽母鵪鶉為研究對(duì)象，對(duì)其性腺軸上的繁殖相關(guān)基因及Leptin/LEPR在兩個(gè)發(fā)育階段的表達(dá)差異進(jìn)行檢測(cè)，探究Leptin/LEPR與鵪鶉繁殖調(diào)控的關(guān)系；以3周

3、齡朝鮮龍城母鵪鶉為研究對(duì)象，對(duì)其進(jìn)行禁食和禁食后恢復(fù)采食處理，分析不同處理?xiàng)l件下促食欲基因、抑食基因以及Leptin/LEPR的差異表達(dá)情況，探究Leptin/LEPR與鵪鶉采食調(diào)控的關(guān)系。主要得到以下結(jié)果：
　　1.運(yùn)用已公布的禽類Leptin序列在日本鵪鶉的SRA數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行同源序列查找，根據(jù)拼接獲得的鵪鶉Leptin序列設(shè)計(jì)PCR引物，首次克隆了鵪鶉Leptin基因外顯子4（參照野生鳥類的基因結(jié)構(gòu)）的部分核苷酸序列；序列分析

4、表明其GC含量較高（64％），其預(yù)測(cè)氨基酸序列與其他脊椎動(dòng)物L(fēng)eptin的氨基酸序列一致性較低，但擁有保守的結(jié)構(gòu)域。
　　2.運(yùn)用兼并引物設(shè)計(jì)和PCR克隆技術(shù)，首次克隆得到了鵪鶉LEPR的CDS序列，同時(shí)鑒定出該受體的四種不同的剪接亞型，其中qLEPRl屬于長(zhǎng)型受體，其預(yù)測(cè)氨基酸序列包含信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)所需的所有保守的基序、結(jié)構(gòu)域和基本的殘基，而其他三種亞型（qLEPR-a、qLEPR-b和qLEPR-c）屬于可溶型受體，缺乏跨膜域和胞內(nèi)

5、域，同時(shí)也缺乏Leptin的綁定結(jié)合域；基因進(jìn)化分析表明，鵪鶉LEPR與Leptin在脊椎動(dòng)物中的進(jìn)化關(guān)系相似，其與家禽尤其是雞形目的物種同源性最高。
　　3.運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對(duì)已獲得的Leptin/LEPR進(jìn)行組織表達(dá)模式的研究，結(jié)果表明，鵪鶉Leptin和LEPR呈廣泛性組織表達(dá)特點(diǎn)，提示其具有廣泛的生物學(xué)功能。鵪鶉Leptin在骨骼肌、胰腺和下丘腦中表達(dá)相對(duì)較高，而LEPR在垂體中極高表達(dá)，提示Leptin/LEP

6、R在鵪鶉的腦部能量平衡的控制、繁殖調(diào)控以及肌肉發(fā)育方面扮演重要角色。鵪鶉Leptin/LEPR在肝臟和脂肪組織中低表達(dá)，表明鵪鶉Leptin不是一個(gè)脂肪依賴性分泌的激素。
　　4.通過對(duì)繁殖相關(guān)基因和Leptin/LEPR在鵪鶉不同發(fā)育階段差異表達(dá)的研究，初步探究了Leptin/LEPR與鵪鶉繁殖調(diào)控的關(guān)系，結(jié)果顯示，與3周齡鵪鶉相比，20周齡鵪鶉繁殖相關(guān)基因（GnRH-I、FSH-β、FSHR和LHR）在性腺軸上顯著上調(diào)表達(dá)，其

7、性腺軸被激活，此時(shí)，Leptin和t-qLEPR（包含鵪鶉LEPR的所有亞型）在其下丘腦和垂體中也上調(diào)表達(dá)，表明Leptin/LEPR與鵪鶉的性腺軸激活存在一定的正相關(guān)關(guān)系；伴隨著鵪鶉的性成熟并進(jìn)入產(chǎn)蛋高峰期，促卵泡發(fā)育和卵巢激素分泌的基因（如：LHR和FSHR）上調(diào)表達(dá)，然而Leptin和t-qLEPR在20周齡鵪鶉的卵巢中表達(dá)下調(diào)，同時(shí)凋亡基因caspase3在其卵泡中的表達(dá)也下調(diào)，表明Leptin/LEPR系統(tǒng)對(duì)鵪鶉卵泡的發(fā)育有一

8、定的抑制效應(yīng)。
　　5.本試驗(yàn)通過對(duì)3周齡鵪鶉進(jìn)行禁食和禁食后恢復(fù)采食處理，并檢測(cè)其促食欲基因（AgRP/NPY）、厭食基因（POMC和MC4R）和Leptin/LEPR的差異表達(dá)情況，初步探究了Leptin/LEPR系統(tǒng)與鵪鶉采食調(diào)控的關(guān)系，結(jié)果顯示，AgRP/NPY在禁食階段顯著上調(diào)，在恢復(fù)采食時(shí)顯著下調(diào)；POMC和MC4R在禁食和恢復(fù)采食階段不同程度的下調(diào)；而Leptin/LEPR的表達(dá)在禁食時(shí)上調(diào)，恢復(fù)采食時(shí)下調(diào)；這些結(jié)果

9、表明Leptin可能不作為抑食因子參與鵪鶉的食欲調(diào)控。
　　綜上所述，鵪鶉Leptin及其受體LEPR被首次克隆獲得，擁有不同于其他動(dòng)物同源物的獨(dú)特的組織表達(dá)模式；鵪鶉Leptin不是一個(gè)脂肪或肝臟依賴性分泌的激素，其在鵪鶉的腦部能量平衡的控制、繁殖調(diào)控以及肌肉發(fā)育方面扮演重要角色；Leptin/LEPR系統(tǒng)與鵪鶉的性腺軸激活存在一定的正相關(guān)關(guān)系，同時(shí)對(duì)鵪鶉卵泡的發(fā)育有一定的抑制效應(yīng)；Leptin可能不作為抑食因子參與鵪鶉的食欲調(diào)