水牛leptin基因表達及其調(diào)控機制的研究.pdf

1、Leptin是由白色脂肪組織分泌的一種重要的厭食因子,主要調(diào)控機體能量代謝平衡,并且也對動物生長發(fā)育、免疫和繁殖等生理過程發(fā)揮重要的作用。目前,對leptin基因的研究多集中在人和嚙齒類動物,在水牛生殖和能量代謝方面鮮有報道。本文以水牛為研究對象,對leptin基因的表達定位,水牛發(fā)情期前后水平變化和動物試驗等方面進行了探索及可能機制研究。取得了如下結(jié)果:
　　 (1)利用隨機引物法對水牛leptincDNA進行地高辛標記,用N

2、BT/BCIP顯色確定其標記效率,結(jié)果雜交斑點顯示檢測精度為0.1pg/μl,達到預期目的。然后再用標記好的探針對水牛下丘腦、垂體、卵巢和睪丸的石蠟組織切片進行原位雜交,結(jié)果(i)下丘腦核區(qū)有大量的陽性黃褐色顆粒即leptinmRNA表達(ii)垂體遠側(cè)部有大量的陽性黃褐色顆粒,并呈密集分布,而中間部卻很少有陽性表達;垂體神經(jīng)部也可見有大量的黃褐色陽性顆粒出現(xiàn),而且多集中在神經(jīng)纖維和毛細血管周圍。(iii)在卵巢卵泡顆粒層細胞與卵泡膜之

3、間有許多黃褐色陽性顆粒,在基質(zhì)中有少量表達;在早期的生長卵泡內(nèi)有大量的leptinmRNA表達,黃褐色陽性顆粒明顯多于卵巢皮質(zhì)其它組織,基質(zhì)中僅有少量表達。(iv)在睪丸生精小管的管壁上有大量的黃褐色陽性著色,而在睪丸間質(zhì)中卻極少有陽性著色。這說明在睪丸組織中存在leptinmRNA的表達,這種表達多集中在精小管的管壁上,管周圍的間質(zhì)組織表達不多。
　　 (2)精心選取健康且年齡、體重和胎次相近的水牛23頭,利用B超準確監(jiān)測其發(fā)

4、情周期,分別在發(fā)情前10天及整個發(fā)情期內(nèi)的相近時間點頸靜脈采血,測定指標leptin,ghrelin,IL-1,IL-6,TP,ALB,TG,TC,Ca,P和UA。結(jié)果顯示leptin與TG水平變化趨勢相近,在發(fā)情期內(nèi)波動劇烈;leptin與ghrelin相關性極顯著(r=0.493),且呈正相關;TP與ALB,IL-1與IL-6,Ca與P密切相關,在整個期間變化較為平穩(wěn),預示著水牛在卵泡發(fā)育前后機體健康指數(shù)正常。
　　 (3)

5、成功構(gòu)建真核表達載體EGFP-leptin。用脂質(zhì)體將載體EGFP-leptin導入NIH/3T3細胞系,經(jīng)24-48h后熒光顯微鏡觀察,用RT-PCR法檢測leptinmRNA的表達,并將表達產(chǎn)物進行SDS-PAGE分析及Westernblot驗證。結(jié)果發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)染24-48h后出現(xiàn)有綠色熒光轉(zhuǎn)染細胞,經(jīng)RT-PCR檢測有目的基因出現(xiàn),Westernblot也發(fā)現(xiàn)清晰的表達帶,表明EGFP-leptin成功在MIH/3T3細胞獲得表達。

6、最后經(jīng)過G418篩選成功獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞株。
　　 (4)利用實時定量PCR技術(shù)對不同分組間小鼠腸系膜脂肪中microRNA-143表達分析,結(jié)果顯示注射(重組leptin,Ⅱ組)組和禁食組(Ⅳ組)小鼠microRNA-143表達均明顯上升,而且注射組(Ⅱ組)小鼠microRNA-143表達增加較快;注射leptin和禁食小鼠3日后體重均減少,其中注射并禁食組(Ⅲ組)日減體重最多;注射和禁食組(Ⅲ組)小鼠血清leptin水平先