elisa方法的及步驟

1、香港生科儀有限公司香港生科儀有限公司BiosciEquipSupplyInternationalCo.，Limited——————————————————————————————————————————___________________________________________________________________________________北京辦事處北京市海淀區(qū)吳家場(chǎng)路1號(hào)唐寧府4號(hào)樓1單元404室郵編1000

2、36.電話及傳真:0106395530613661397601email:jclrm@vip.Web：一、一、ELISA方法的及步驟：方法的及步驟：ELISA是酶聯(lián)接免疫吸附劑測(cè)定(EnzymeLinkedImmunosbnentAssay)的簡(jiǎn)稱。它是繼免疫熒光和放射免疫技術(shù)之后發(fā)展起來(lái)的一種免疫酶技術(shù)。此項(xiàng)技術(shù)自70年代初問(wèn)世以來(lái)，發(fā)展十分迅速，目前已被廣泛用于生物學(xué)和醫(yī)學(xué)科學(xué)的許多領(lǐng)域。(一)原理ELISA是以免疫學(xué)反應(yīng)為基礎(chǔ)，將

3、抗原、牽9體的特異性反應(yīng)與酶對(duì)底物的高效催化作用相結(jié)合起來(lái)的一種敏感性很高的試驗(yàn)技術(shù)。由于抗原、抗體的反應(yīng)在一種固相載體──聚苯乙烯微量滴定板的孔中進(jìn)行，每加入一種試劑孵育后，可通過(guò)洗滌除去多余的游離反應(yīng)物，從而保證試驗(yàn)結(jié)果的特異性與穩(wěn)定性。在實(shí)際應(yīng)用中，通過(guò)不同的設(shè)計(jì)，具體的方法步驟可有多種。即:用于檢測(cè)抗體的間接法(圖a)、用于檢測(cè)抗原的雙抗體夾心法(圖b)以及用于檢測(cè)小分子抗原或半抗原的抗原競(jìng)爭(zhēng)法等等。比較常用的是ELISA雙抗體

4、夾心法及ELISA間接法。(二)操作步驟方法一用于檢測(cè)未知抗原的雙抗體夾心法:1.包被：用0.05MPH9.牰碳酸鹽包被緩沖液將抗體稀釋至蛋白質(zhì)含量為1～10μg／ml。在每個(gè)聚苯乙烯板的反應(yīng)孔中加0.1ml，4℃過(guò)夜。次日，棄去孔內(nèi)溶液，用洗滌緩沖液洗3次，每次3分鐘。(簡(jiǎn)稱洗滌，下同)。2.加樣：加一定稀釋的待檢樣品0.1ml于上述已包被之反應(yīng)孔中，置37℃孵育1小時(shí)。然后洗滌。(同時(shí)做空白孔，陰性對(duì)照孔及陽(yáng)性對(duì)照孔)。3.加酶標(biāo)抗

5、體：于各反應(yīng)孔中，加入新鮮稀釋的酶標(biāo)抗體(經(jīng)滴定后的稀釋度)0.1ml。37℃孵育0.5～1小時(shí)，洗滌。4.加底物液顯色：于各反應(yīng)孔中加入臨時(shí)配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃10～30分鐘。5.終止反應(yīng)：于各反應(yīng)孔中加入2M硫酸0.05ml。6.結(jié)果判定：可于白色背景上，直接用肉眼觀察結(jié)果：反應(yīng)孔內(nèi)顏色越深，陽(yáng)性程度越強(qiáng)，陰性反應(yīng)為無(wú)色或極淺，依據(jù)所呈顏色的深淺，以“”、“”號(hào)表示。也可測(cè)OD值：在ELISA檢測(cè)儀上，于450nm

6、(若以ABTS顯色，則410nm)處，以空白對(duì)照孔調(diào)零后測(cè)各孔OD值，若大于規(guī)定的陰性對(duì)照OD值的2.1倍，即為陽(yáng)性。方法二用于檢測(cè)未知抗體的間接法：用包被緩沖液將已知抗原稀釋至1～10μg／ml，每孔加0.1ml，4℃過(guò)夜。次日洗滌3次?！右欢ㄏ♂尩拇龣z樣品(未知抗體)0.1ml于上述已包被之反應(yīng)孔中置37℃孵育1小時(shí)洗滌。(同時(shí)做空白、陰性及陽(yáng)性孔對(duì)照)↓香港生科儀有限公司香港生科儀有限公司BiosciEquipSupplyInt

7、ernationalCo.，Limited——————————————————————————————————————————___________________________________________________________________________________北京辦事處北京市海淀區(qū)吳家場(chǎng)路1號(hào)唐寧府4號(hào)樓1單元404室郵編100036.電話及傳真:0106395530613661397601email:j

8、clrm@vip.Web：加蒸餾水50ml。(6)TMB(四甲基聯(lián)苯胺)使用液:TMB(10mg／5ml無(wú)水乙醇)0.5ml底物緩沖液(PH5.5)10ml0.75％H２O２32μl(7)ABTS使用液:ABTS0.5mg底物緩沖液(PH5.5)1ml3％H２O２2μl(8)抗原、抗體和酶標(biāo)記抗體。(9)正常人血清和陽(yáng)性對(duì)照血清。2.器材:(1)聚苯乙烯塑料板(簡(jiǎn)稱酶標(biāo)板)40孔或96孔，ELISA檢測(cè)儀，50μl及100μl加樣器，塑

9、料滴頭，小毛巾，洗滌瓶。(2)小燒杯、玻璃棒、試管、吸管和量筒等。(3)4℃冰箱，37℃孵育箱。(四)注意事項(xiàng)1.正式試驗(yàn)時(shí)，應(yīng)分別以陽(yáng)性對(duì)照與陰性對(duì)照控制試驗(yàn)條件，待檢樣品應(yīng)作一式二份，以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。有時(shí)本底較高，說(shuō)明有非特異性反應(yīng)，可采用羊血清、兔血清或BSA等封閉。2.在ELISA中，進(jìn)行各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)條件的選擇是很重要的，其中包括:(1)固相載體的選擇：許多物質(zhì)可作為固相載體，如聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺和纖維素等。其形式

10、可以是凹孔平板、試管、珠粒等。目前常用的是40孔聚苯乙烯凹孔板。不管何種載體，在使用前均可進(jìn)行篩選：用等量抗原包被，在同一實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)行反應(yīng)，觀察其顯色反應(yīng)是否均一性，據(jù)此判明其吸附性能是否良好。（2)包被抗體(或抗原)的選擇：將抗體(或抗原)吸附在固相載體表面時(shí)，要求純度要好吸附時(shí)一般要求PH在9.0～9.6之間。吸附溫度，時(shí)間及其蛋白量也有一定影響一般多采用4℃18～24小時(shí)。蛋白質(zhì)包被的最適濃度需進(jìn)行滴定：即用不同的蛋白質(zhì)濃度(0