農桿菌質粒載體系統(tǒng)

1、農桿菌質粒載體系統(tǒng)質粒載體系統(tǒng)中最常用的質粒有：Ti質粒和Ri質粒。Ti質粒存在于根癌農桿菌(Agrobacteriumtumefaciens）中，Ri質粒存在于發(fā)根農桿菌（Agrobacteriumrhizogenis）中。Ti質粒和Ri質粒在結構和功能上有許多相似之處，具有基本一致的特性。但實際工作中，絕大部分采用Ti質粒。農桿菌質粒是一種能實現(xiàn)DNA轉移和整合的天然系統(tǒng)。Ti質粒有兩個區(qū)域：TDNA區(qū)（是質粒上能夠轉移整合入植物受

2、體基因組并能在植物細胞中表達從而導致冠癭瘤的發(fā)生，且可通過減數(shù)分裂傳遞給子代的區(qū)域）和Vir區(qū)（編碼能夠實現(xiàn)TDNA轉移的蛋白）。TDNA長度為1224kb之間，兩端各有一個含25bp重復序列的邊界序列，在整合過程中左右邊界序列之間的TDNA可以轉移并整合到宿主細胞基因組中，研究發(fā)現(xiàn)只有邊界序列對DNA的轉移是必需的，而邊界序列之間的TDNA并不參與轉化過程，因而可以用外源基因將其替換。Vir區(qū)位于TDNA以外的一個35kb內，其產物對

3、TDNA的轉移及整合必不可少。農桿菌侵染植物首先是吸附于植物表面?zhèn)?，受傷植物分泌的酚類小分子化合物可以誘導Vir基因的表達。Vir產物能誘導Ti質粒產生一條新的TDNA單鏈分子。此單鏈分子從Ti質粒上脫離后，可以與Vir產物VIRD2蛋白共價結合，并在VIRD4和VIRB等蛋白的幫助下從農桿菌進入植物細胞的染色體中。由于野生型Ti質粒過于龐大，約200800kb，為了便于重組DNA操作，研究人員對Ti質粒進行了改造從而構建一系列合適的

4、Ti衍生載體。首先除掉了野生型Ti質粒TDNA區(qū)的一段DNA片段。例如：參與植物Ti通過體外操作導入外源基因是非常必要的。從結構特點看可分為兩類中間載體：即共整合系統(tǒng)中間載體和雙元系統(tǒng)中間載體。根據兩類中間載體，目前已開發(fā)出兩類轉化體系：一類是一元載體系統(tǒng)（整合載體系統(tǒng)），這一類載體系統(tǒng)由一個共整合系統(tǒng)中間表達載體與改造后的受體Ti質粒組成。在農桿菌內，通過同源重組將外源基因整合到修飾過的TDNA上，形成可穿梭的共整合載體，在Vir基因

5、產物的作用下完成目的基因向植物細胞的轉移和整合。但這類方法構建困難，整合體形成率低，一般不常用。另一類轉化體系是雙元載體系統(tǒng)，它由兩個分別含有TDNA和Vir區(qū)的相容性突變Ti質?！⑿蚑i質粒（miniTiplas）和輔助Ti質粒（helperTiplas）構成，TDNA和Vir基因在兩個獨立的質粒上，通過反式激活TDNA轉移到植物細胞基因組內。微型Ti質粒就是含有TDNA邊界但缺失Vir基因的Ti質粒，為一個廣譜質粒。它含有一個廣

6、泛寄主范圍質粒的復制起始位點（iV），同時具有選擇性標記基因。輔助質粒為含有Vir區(qū)段但TDNA缺失的突變型質粒，完全喪失了致瘤的功能。因此相當于共整合載體系統(tǒng)中的卸甲質粒。其作用是提供Vir基因功能。激活處于反式位置上的TDNA轉移。將微型質位轉入到含有輔助性Ti質粒農桿菌的途徑有兩條：一條是直接用純化的微型Ti質粒轉化速凍的根癌農桿菌感受態(tài)細胞；另一條途徑是采用三親交配方法，三親交配由含微型Ti質粒的E.coli、含有助動質粒pRK