質(zhì)粒載體的構(gòu)建

1、質(zhì)粒載體的構(gòu)建摘要：質(zhì)粒載體的構(gòu)建。首先要獲得目的DNA。根據(jù)其目的基因序列和啟動(dòng)子序列設(shè)計(jì)引物，為提高目的基因產(chǎn)率，采用兩次PCR的方法，即第一次設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增全序列基因，第二次設(shè)計(jì)帶酶切位點(diǎn)的引物以第一次擴(kuò)增產(chǎn)物為模板進(jìn)行擴(kuò)增，進(jìn)而加尾連接到TDNA上，再利用電轉(zhuǎn)化的方法將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到帶有PCAMBIA1381的DH5α感受態(tài)細(xì)胞中復(fù)制表達(dá)。關(guān)鍵詞：質(zhì)粒DNAPCR電泳感受態(tài)轉(zhuǎn)化1.引言質(zhì)粒（plas）是細(xì)菌或細(xì)胞染色質(zhì)以外的，能自

2、主復(fù)制的，與細(xì)菌或細(xì)胞共生的遺傳成分。其特點(diǎn)如下：①是染色質(zhì)外的雙鏈共價(jià)閉合環(huán)形DNA（cccDNA），可自然形成超螺旋結(jié)構(gòu)，不同質(zhì)粒大小在2300kb之間，＜15kb的小質(zhì)粒比較容易分離純化，＞15kb的大質(zhì)粒則不易提取。②能自主復(fù)制，是能獨(dú)立復(fù)制的復(fù)制子。一般質(zhì)粒DNA復(fù)制的質(zhì)粒可隨宿主細(xì)胞分裂而傳給后代。③質(zhì)粒對(duì)宿主生存并不是必需的。某些質(zhì)粒攜帶的基因功能有利于宿主細(xì)胞的特定條件下生存，例如，細(xì)菌中許多天然的質(zhì)粒帶有抗藥性基因，如

3、編碼合成能分解破壞四環(huán)素、氯霉素、氨芐表霉素等的酶基因，這種質(zhì)粒稱為抗藥性質(zhì)粒，又稱R質(zhì)粒，帶有R質(zhì)粒的細(xì)菌就能在相應(yīng)的抗生素存在生存繁殖。所以質(zhì)粒對(duì)宿主不是寄生的，而是共生的?，F(xiàn)在分子生物學(xué)使用的質(zhì)粒載體都已不是原來(lái)細(xì)菌或細(xì)胞中天然存在的質(zhì)粒，而是經(jīng)過(guò)了許反向引物：sinn3R冰盒標(biāo)注：P2b引物序列：5’—GCAAGAGCGTCGTTTGTAGTTA—3’引物長(zhǎng)度：22bp第二次引物設(shè)計(jì)（帶酶切位點(diǎn)）：正向引物：sinn3FE冰盒標(biāo)

4、注：P2c引物序列：5’—ACTGGATCCAAGCAAAATCTAACCGTGTAATGTA—3’引物長(zhǎng)度：34bp反向引物：sinn3RE冰盒標(biāo)注：P2d引物序列：5’—TCACTGCAGCTCATAAGACCAAAGAACGTTTCTT—3’引物長(zhǎng)度：34bp2.1.2PCR擴(kuò)增2.1.2.1PCR技術(shù)的基本原理PCR即聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)是指在DNA聚合酶的催化下以母鏈DNA為模板以特定引物為延伸起點(diǎn)通過(guò)變性、延伸、復(fù)性等步驟體外復(fù)制