XJ-160病毒質粒型復制子載體系統(tǒng)的建立及其功能鑒定.pdf

1、目的：
　　 XJ-160病毒是1990年從我國新疆境內捕獲的按蚊中分離到的一株病毒,經(jīng)鑒定為甲病毒屬辛德畢斯病毒(Sindbis virus,SINV)。目前本課題組已完成該病毒的全基因組序列測定,全基因組感染性cDNA克隆(pBR-XJ160)的構建及RNA型復制子載體系統(tǒng)的建立。但RNA型復制子載體的啟動子為原核啟動子,應用時需要進行體外轉錄,操作繁瑣。與其相比,質粒型復制子載體可通過真核啟動子(如CMV)啟動轉錄,無需體

2、外轉錄可直接轉染到細胞中實現(xiàn)高水平外源基因的表達。鑒于此,本研究擬在pBR-XJ160基礎上構建XJ-160病毒質粒型復制子載體系統(tǒng),并對其進行定性、定量的功能鑒定。
　　 方法：
　　 1.XJ-160病毒質粒型復制子載體pVa-XJ的構建:以XJ-160病毒感染性全基因克隆pBR-XJ160為模板通過PCR將病毒非結構基因序列分為三個片段擴增:XJ1(1-2527nt),XJ2(2527-5161nt),XJ3(51

3、61-7562nt),采用分步克隆的方法將其依次克隆至真核表達載體pVAX1 CMV啟動子下游,所用單一限制性內切酶分別為:NheI/BamHI,BamHI/EcoRI和EcoRI/NotI,并用多克隆位點(multiple clone sites,MCS)序列替代病毒的結構基因,MCS由Nofl,PvuI,FseI,PaeI和AscI五種單一限制性內切酶酶切位點序列構成。
　　 2.輔助質粒的構建:輔助質?？蔀閺椭谱虞d體反式提

4、供病毒結構蛋白,以便包裝出復制缺陷型的病毒顆粒,并最終提高載體的包裝效率。因此,以感染性全基因克隆pBR-XJ160質粒為基礎分別擴增病毒核蛋白基因C(7563-8354nt)及包膜糖蛋白基因E(8355-11297nt)分別將其克隆至pVAX1 CMV啟動子下游構建載體的兩個輔助質粒pVa-C和pVa-E,所用單一限制性內切酶分別為:EcoRI/XhoI和BamHI/XhoI。
　　 3.復制子載體系統(tǒng)的功能鑒定:將綠色熒光蛋

5、白(Enhanced green fluorecentprotein,EGFP)報告基因及海腎熒光素酶(Gaussia Luciferase,GLUC)報告基因分別插入復制子載體的多克隆位點構建了含有報告基因的表達質粒pVaXJ-EGFP和pVaXJ-GLUC,所用單一限制性內切酶分別為:NotI/AscI和FseI/AscI。將報告基因表達質粒與輔助質粒共轉染BHK-21細胞觀察綠色熒光蛋白的表達情況及檢測海腎熒光素酶的活性以對復制子

6、載體系統(tǒng)進行定性、定量的功能鑒定。
　　 結果
　　 1.構建了XJ-160病毒質粒型復制子載體pVa-XJ,用引入的單一限制性內切酶NotI,PvuI,FseI,PacI和AscI均可以將載體質粒線性化,可獲得長約10.5kb的線性載體片段;用NheI/BamHI,BamHI/EcoRI和EcoRI/NotI雙酶切均可獲得長度約為2.5kb和8kb的線性片段,基因測序結果也表明所構建的載體序列正確。
　　 2.

7、構建了XJ-160病毒質粒型復制子載體的兩個輔助質粒pVa-C和pVa-E,用單一限制性內切酶EcoRI/XhoI雙酶切質粒pVa-C可得到長約0.79kb的核蛋白基因片段和長約3kb的線性pVAX1,用單一限制性內切酶BamHI或XhoI單酶切質粒pVa-E均可得到長約6kb的線性pVa-E片段,基因測序結果也表明所構建的輔助質粒序列正確。
　　 3.對XJ-160病毒質粒型復制子載體系統(tǒng)進行定性的功能鑒定,用單一限制性內切酶

8、NotI/AscI雙酶切質粒pVaXJ-EGFP可得到長約0.7kb的EGFP基因片段和長約10.5kb的線性pVa-XJ,測序鑒定結果也顯示我們成功構建了綠色熒光蛋白表達質粒。將pVaXJ-EGFP及輔助質粒pVa-C和pVa-E共轉染BHK-21細胞,轉染24h后觀察到綠色熒光蛋白的表達。
　　 4.對XJ-160病毒質粒型復制子載體系統(tǒng)進行定量的功能鑒定,用單一限制性內切酶FseI/AscI雙酶切質粒pVaXJ-GLUC可

9、得到長約0.59kb的GLUC基因片段和長約10.5kb的線性pVa-XJ,測序鑒定結果也顯示我們成功構建了海腎熒光素酶表達質粒。將pVaXJ-GLtJC及輔助質粒pVa-C和pVa-E共轉染BHK-21細胞,轉染24h后我們所構建的復制子載體pVa-XJ所包裝的Gluc在BHK-21細胞中的活性開始增強,至30h達到最高值(7.8×104)。在轉染后30-48h載體所包裝的G.luc的活性顯著下降,48h時活性(3.0×104)。轉染