原位雜交技術(shù)的操作詳解及小貼士

1、原位雜交技術(shù)的操作詳解及小貼士原位雜交技術(shù)應(yīng)用于染色體、細(xì)胞和組織切片等樣品中進(jìn)行核酸特異性檢測(cè)，與免疫組化技術(shù)的結(jié)合應(yīng)用，能將DNA、mRNA和蛋白水平上的基因活性與樣品的顯微拓?fù)湫畔⒔Y(jié)合起來(lái)。1969年P(guān)ardue和Gall將放射性標(biāo)記的探針直接應(yīng)用于純化核酸的雜交，此后得益于分子克隆技術(shù)的發(fā)展，及不同探針標(biāo)記系統(tǒng)和檢測(cè)系統(tǒng)的應(yīng)用，大大增加了原位雜交檢測(cè)的應(yīng)用靈活性和檢測(cè)靈敏度。多種探針標(biāo)記檢測(cè)系統(tǒng)基于地高辛、生物素和熒光標(biāo)記分子的

2、標(biāo)記和檢測(cè)系統(tǒng)是常見(jiàn)的原位雜交檢測(cè)方法。熒光標(biāo)記檢測(cè)常為直接探針標(biāo)記方法，如在dUTPUTPddUTP上連接Fluescein后進(jìn)行核酸標(biāo)記。由于標(biāo)記在核酸上的熒光分子必須經(jīng)受雜交和洗脫過(guò)程中的考驗(yàn)，以及熒光分子易于衰減，其檢測(cè)靈敏度受到一定的影響。但對(duì)熒光分子的直接檢測(cè)呈現(xiàn)的背景較低。間接標(biāo)記的方法中應(yīng)用了報(bào)告分子標(biāo)記的探針，報(bào)告分子通過(guò)親和酶促的方法進(jìn)行顯色。常用的報(bào)告分子如地高辛，生物素。結(jié)合地高辛抗體或鏈霉親和素上耦聯(lián)的酶系統(tǒng)進(jìn)

3、行間接的底物反應(yīng)檢測(cè)。地高辛標(biāo)記核酸的歷史可追溯到1987年，由于地高辛是洋地黃的花和葉中特有的成分，檢測(cè)時(shí)使用的地高辛抗體不會(huì)結(jié)合于其他的生物分子。這是相較于生物素標(biāo)記系統(tǒng)的優(yōu)勢(shì)。地高辛抗體上可耦聯(lián)堿性磷酸酶、過(guò)氧化酶，及熒光分子和膠體金等，根據(jù)不同的應(yīng)用需求，呈現(xiàn)高信噪比的核酸檢測(cè)結(jié)果。但需注意，由于引入了免疫檢測(cè)反應(yīng)，在放大檢測(cè)靈敏度的同時(shí)，應(yīng)注意樣品內(nèi)源性酶的滅活，以降低檢測(cè)背景。切片的原位雜交，為了在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中不丟失組織樣品，

4、可使用多聚賴(lài)氨酸或鉻礬明膠包被的載玻片。樣品的固定步驟是為了保持樣品的原有形態(tài)學(xué)。樣品固定是原位雜交中必不可少的步驟，從化學(xué)反應(yīng)角度來(lái)看，固定劑的使用和選擇對(duì)后續(xù)雜交的影響不會(huì)太大，因?yàn)楹怂犭s交的功能分子基團(tuán)被安全地包裹在DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)中，而交聯(lián)劑的使用對(duì)RNA基本沒(méi)有影響。對(duì)于染色體涂片，常使用甲醇醋酸溶液固定；石蠟包埋的組織切片用福爾馬林固定。冷凍切片可通過(guò)在4%的甲醛溶液中固定30min，或使用Bouin固定劑。2.樣品預(yù)處理在

5、待測(cè)樣品中，DNA或RNA通常都是被蛋白包裹纏繞，根據(jù)不同的細(xì)胞和組織樣品的應(yīng)用，可選擇合適的預(yù)處理方法將靶核酸暴露：內(nèi)源性酶滅活：如果探針的檢測(cè)是通過(guò)酶促法進(jìn)行的，則樣品內(nèi)相應(yīng)的內(nèi)源性酶必須被滅活。如內(nèi)源性的POD可通過(guò)含1%H2O2的甲醛溶液處理30min。如果檢測(cè)酶為AP，可在底物溶液中加入左旋咪唑，AP檢測(cè)的內(nèi)源性背景一般來(lái)說(shuō)比POD檢測(cè)的低得多，因?yàn)樵陔s交過(guò)程中，樣品中內(nèi)源性AP酶的活性基本都喪失了。RNase處理：在DNAD