原位雜交組織化學(xué)概述

1、原位雜交組織化學(xué)概述原位雜交組織化學(xué)概述一、核酸分子雜交技術(shù)一、核酸分子雜交技術(shù)1961年Hall開拓了液相核酸雜交技術(shù)的研究，其基本原理是利用核酸分子開拓了液相核酸雜交技術(shù)的研究，其基本原理是利用核酸分子單鏈之間有互補(bǔ)的堿基順序，通過堿基對之間非共價(jià)鍵的形成，出現(xiàn)穩(wěn)定的雙單鏈之間有互補(bǔ)的堿基順序，通過堿基對之間非共價(jià)鍵的形成，出現(xiàn)穩(wěn)定的雙鏈區(qū)，形成雜交的雙鏈。鏈區(qū)，形成雜交的雙鏈。自此以后，由于分子生物學(xué)技術(shù)的迅猛發(fā)展，特別是70年代

2、末到80年代初，分子克隆、質(zhì)粒和噬菌體DNA的構(gòu)建成功，核酸自動(dòng)合成儀的誕生，大大豐富了核酸探針的來源，新的核酸分子雜交類型和方法不斷涌現(xiàn)。按其作用方式可大致分為固相雜交和液相雜交兩種：液相雜交是指參按其作用方式可大致分為固相雜交和液相雜交兩種：液相雜交是指參加反應(yīng)的兩條核酸鏈都游離在溶液中，而固相雜交是將參加反應(yīng)的一條核酸鏈加反應(yīng)的兩條核酸鏈都游離在溶液中，而固相雜交是將參加反應(yīng)的一條核酸鏈固定在固體的支持物上常用的有硝酸纖維素濾膜，

3、其它如尼龍膜、乳膠顆粒和固定在固體的支持物上常用的有硝酸纖維素濾膜，其它如尼龍膜、乳膠顆粒和微孔板等），另一條參加反應(yīng)的核酸鏈游離在溶液中。微孔板等），另一條參加反應(yīng)的核酸鏈游離在溶液中。固相雜交有菌落原位雜交（colonyinsituhybridization）、斑點(diǎn)雜交法（Dotblot）、Southern印跡雜交（Southernblot）、Nthern印跡雜交（Nthernblot）和組織原位雜交（Tissueinsituhyb

4、ridization），即原位雜交組織化學(xué)技術(shù)和原位雜交免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)。液相分子雜交技術(shù)包括吸附雜交、發(fā)光液相雜交、液相夾心雜交和復(fù)性速率液相分子雜交等。二、原位雜交組織化學(xué)技術(shù)的由來及發(fā)展二、原位雜交組織化學(xué)技術(shù)的由來及發(fā)展原位雜交組織（或細(xì)胞）化學(xué)技術(shù)簡稱原位雜交（Insituhybridization），如上所述，屬于固相核酸分子雜交的范疇。但它區(qū)別于固相核酸分子雜交中的任何一種核酸分子雜交技術(shù)。菌落雜交系細(xì)菌裂解釋放出DNA，

5、然后進(jìn)行雜交。Southern印跡雜交法是以鑒定印跡雜交法是以鑒定DNA中某一特定的基因片段，而中某一特定的基因片段，而Nhtern印跡印跡雜交法是用以檢測某一特定的雜交法是用以檢測某一特定的RNA片段的。它們都只能證明該病原體、細(xì)胞或片段的。它們都只能證明該病原體、細(xì)胞或組織中是否存在待測的核酸而不能證明該核酸分子在細(xì)胞或組織中存在的部位。組織中是否存在待測的核酸而不能證明該核酸分子在細(xì)胞或組織中存在的部位。1969年美國耶魯大學(xué)Ga

6、ll和Pardue首先用爪蟾核糖體基因探針與其卵母細(xì)胞雜交，確定該基因定位于卵母細(xì)胞的核仁中。與此同時(shí)，Buongino–Nardelli和AmaldiJohn及其同事等相繼利用同位素標(biāo)記核酸探針進(jìn)行了細(xì)胞或組織的基因定位，從而創(chuàng)造了原位雜交細(xì)胞或組織化學(xué)技術(shù)。th（1970）應(yīng)用3H標(biāo)記的兔乳頭狀瘤病毒cRNA探針與兔乳頭狀瘤組織的冰凍切片進(jìn)行雜交，首次用原位雜交檢測了病毒DNA在細(xì)胞中的定位，但當(dāng)時(shí)的工作多采用冰凍組織切片或培養(yǎng)細(xì)胞

7、，探針均采用同位素標(biāo)記。DNA探針，繼之Temin在70年代研究致癌RNA病毒時(shí)制備了cDNA探針探針（complementaryDNA），），其基本原理是以RNA為模板，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄酶（reversetranase）又稱為RNA指導(dǎo)的DNA聚合酶催化產(chǎn)生的。該酶以RNA為模板，按照RNA的核苷酸順序合成DNA，這一途徑與一般遺傳信息流的方向相反，故稱逆轉(zhuǎn)錄。CDNA是指互補(bǔ)于mRNA的DNA分子。RNA探針是將特異性的cDNA片段插入含有

8、相當(dāng)?shù)腞NA聚合酶啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄性載體。這類載體包括pSP64和pSP65，它們具有不同的啟動(dòng)子在多克隆位點(diǎn)的各側(cè)。Psp64和pSP65在sP6啟動(dòng)子的多克隆位點(diǎn)的方向是不同的。通過改變外源基因的插入方向或選用不同的RNA聚合酶，可以控制RNA的轉(zhuǎn)錄方向，即以哪條DNA鏈為模反轉(zhuǎn)錄RNA。從而可以得到與mRNA同序列的同義RNA探針（Senseprobe）和與mRNA互補(bǔ)的反義RNA探針（antisenseprobe），又稱互補(bǔ)RNA探

9、針（complementaryRNAprobecRNA）。通常用同義RNA探針做為反義RNA探針的陰性對照。由于RNA探針是單鏈分子，所以它與靶序列的雜交反應(yīng)極高。有報(bào)告認(rèn)為其雜交率高于DNA探針的8倍。DNA合成儀的誕生使制造寡核苷酸探針成為可能，與上述探針不同的是寡核苷酸探針不是克隆性DNA探針，它是由DNA合成儀依照所需雜交的靶核苷酸序列合成的。具有制造方便，價(jià)格低廉的優(yōu)點(diǎn)，也可進(jìn)行放射性與非放射性標(biāo)記，但其特異性不如克隆性探針強(qiáng)

10、，亦不如其雜交信號高。原位雜交組織化學(xué)技術(shù)在近20年的發(fā)展可以說是飛躍的，其突出的特點(diǎn)是由分子遺傳學(xué)研究提供的探針大量增加，探針生產(chǎn)的可靠性和速率大大發(fā)展了，更重要的是非放射性標(biāo)記物的發(fā)展使原位雜交組織化學(xué)技術(shù)在不久的將來將和現(xiàn)今的免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)一樣成為實(shí)驗(yàn)室的常規(guī)技術(shù)和臨床日常應(yīng)用的診斷技術(shù)。新的非放射性標(biāo)記技術(shù)正在繼續(xù)不斷涌現(xiàn)。Coulton（1991）建議將非放射性標(biāo)記技術(shù)更名為親合復(fù)合物標(biāo)記技術(shù)（Affinity–Comple

11、xLabelledProbesACLP）。因?yàn)椤胺牵╪on）“在英文里是一個(gè)否定的名詞，而且根據(jù)非放射性標(biāo)記技術(shù)的原理是將一個(gè)標(biāo)記物利用其親合性，應(yīng)用直接或間接的方法結(jié)合在核苷酸分子上。原位雜交組織化學(xué)技術(shù)在生命科學(xué)的研究中可視為一項(xiàng)革命性的技術(shù)。它使它們的研究從器官、組織和細(xì)胞水平走向分子水平。為各個(gè)學(xué)科的研究帶來突破性的進(jìn)展。其中特別突出的是細(xì)胞或組織的基因表達(dá)、染色體分析、病毒診斷和發(fā)育生物學(xué)。我們在下節(jié)將詳加敘述。三、原位雜交組