樹莓熒光原位雜交體系的建立及優(yōu)化.pdf

1、樹莓(RubusL.)，又名懸鉤子，屬于薔薇科(Rosaceae)懸鉤子屬(Rubus)多年生小灌木類落葉果樹。中國樹莓植物種類繁多、分布廣泛，大都以野生狀態(tài)存在，遺傳背景復(fù)雜，目前我國樹莓植物資源的鑒定方法主要集中在形態(tài)學(xué)標(biāo)記、孢粉學(xué)標(biāo)記和細(xì)胞學(xué)標(biāo)記，而采用分子生物學(xué)等手段的研究還相對較少。通過對熒光原位雜交(FISH)過程各個(gè)因素進(jìn)行篩選和評價(jià)，建立了適于樹莓的FISH體系，并用45SrDNA探針對栽秧泡進(jìn)行FISH初步定位驗(yàn)證，實(shí)

2、驗(yàn)結(jié)果如下：
　　 (1)45SrDNA在栽秧泡染色體的位置主要在短染色體，長染色體的著絲粒區(qū)，短染色體的著絲粒區(qū)至短臂區(qū)三種現(xiàn)象，臂比值＞4:1的染色體中出現(xiàn)45SrDNA的現(xiàn)象較少，只有2號染色體的著絲粒區(qū)出現(xiàn)一個(gè)很弱的信號，45SrDNA出現(xiàn)在著絲粒區(qū)至短臂區(qū)占50％左右。核型公式為2n=12sm+2t。
　　 (2)適于樹莓植物熒光原位雜交的根尖壓片法是：當(dāng)根尖長至1～2cm、扦插環(huán)境氣溫17～23℃取材，用0.

3、002mol/L8-羥基喹啉4℃處理24h，卡洛氏固定液Ⅰ（乙醇：冰醋酸=3:1）4℃固定24h，再用1mol/LHCl60℃恒溫解離30～40sec，最后用45％醋酸壓片，液氮揭片。
　　 (3)用烏泡子的45SrDNA核苷酸序列(GeneBank:FJ472913)設(shè)計(jì)PCR特異引物，對影響PCR擴(kuò)增結(jié)果的引物濃度和Mg2+濃度等因素通過正交設(shè)計(jì)進(jìn)行優(yōu)化篩選，在16個(gè)組合中，1、2、3、4、12、13和14號的電泳條帶清晰，

4、7至10號的電泳條帶較弱，5、6、11和16號未出現(xiàn)條帶。經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)，電泳條帶清晰的組合其引物濃度均為5ng,其余的因素對結(jié)果影響不大。因此，本研究選擇效果較好的1號做為45SrDNA的PCR擴(kuò)增體系。其PCR擴(kuò)增體系為：5ng樹莓DNA模板，0.5μMeachPrimer，2mMdNTP,12.5mMMg2+,0.75MTaqDNA酶，2μLPCRBuffer。
　　 (4)通過對染色體標(biāo)本的變性條件、雜交探針用量和雜交后洗脫

5、強(qiáng)度等進(jìn)行優(yōu)化篩選所建立的樹莓植物的FISH體系是：載玻片浸入2×SSC含100μg/mLRNAse37℃恒溫1h，用2×SSC洗滌2×5min，染色體用4％多聚甲醛(pH=7.5)處理10min,2×SSC洗滌，然后用70％,95％和無水乙醇梯度脫水，每次5min，氣干，染色體在0.2XSSC含70％甲酰胺溶液中70℃恒溫處理3min，立即用-20℃預(yù)冷的70％,95％和無水乙醇梯度脫水，氣干。雜交液的組成：5ng/μL探針DNA,5

6、×SSC,50％甲酰胺，10％DS,0.1％SDS和3ng/mL變性的鮭魚精DNA。雜交液沸水浴變性5min，立即冰浴10min，以20μL/片雜交液封片。37℃雜交過夜，雜交后浸入2×SSC除去蓋玻片，制片在0.1×SSC含20％去離子甲酰胺的溶液中42℃恒溫處理30min,2×SSC洗滌3次，每次5min。然后用2×SSC含0.2％Tween-20洗滌3min,ddH2O洗滌，自然晾干。制片用5μg/mLAvidin-FITC溶液3