免疫組化(immunohistochemistry)技術常見問題

1、免疫組化（Immunohistochemistry）技術常見問題1、一抗的選擇要點和技巧是什么？、一抗的選擇要點和技巧是什么？（1）單克隆和多克隆抗體的選擇。由一種克隆產生的特異性抗體叫做單克隆抗體。單克隆抗體能目標明確地與單一的特異抗原決定簇結合，就像導彈精確地命中目標一樣。另一方面，即使是同一個抗原決定簇，在機體內也可以由好幾種克隆來產生抗體，形成好幾種單克隆抗體混雜物，稱為多克隆抗體。在抗原抗體反應中，一般單克隆抗體特異性強，但親

2、和力相對小，檢測抗原靈敏度相對就低；而多克隆抗體特異性稍弱，但抗體的親和力強，靈敏度高，但易出現(xiàn)非特異性染色（可以通過封閉等避免）。（2）應用范圍的選擇。有的一抗只能用于Westernblotting，或免疫組化、免疫熒光、免疫沉淀等；甚至表明石蠟切片或冰凍切片。（3）種屬反應性的選擇（speciesreactivity）。這一點很重要，表明這種抗體可能存在種屬差異，且這種抗體適合檢測哪種種屬動物體內的抗原。（4）種屬來源，一般兔來源的

3、多是多克??；而小鼠來源的多是單克隆，但也有另外。根據此來源來選擇相應的二抗。（5）生產廠家的選擇。不同廠家的同一種抗體它的實際效價穩(wěn)定是不同的。2、石蠟切片和冰凍切片的比較？、石蠟切片和冰凍切片的比較？（1）要求做冰凍切片的不一定能做石蠟切片，這是今天我向一老師請教得出的結論。因為作石蠟切片時要高溫烤片，可能會破壞組織的抗原性，如果組織的抗原性較穩(wěn)定，則可作石蠟切片；但是要求做石蠟切片的，可作冰凍切片。（2）冰凍切片的優(yōu)點是能夠較好的保

4、存組織的抗原免疫活性，做免疫組化時不需抗原修復這一步。缺點是細胞內易形成冰晶而破壞細胞結構，可能會使抗原彌散；切片厚度較石蠟的厚，做的片子沒石蠟的漂亮。當你買一抗時，目錄上都寫著做什么樣的切片，如果它寫著只能做冰凍，就不能做石蠟，如寫著兩者都可，那就都能做。（3）石蠟切片的優(yōu)點可以保持組織細胞的形態(tài)結構，且容易存放在室溫，而冰凍切片比較麻煩，一定要存在80度的低溫冰箱中，尤其是用來做原位雜交的的切片，為了防止RNA降解，保存一貫很重要。

5、由于石蠟切片可以切到4微米左右，所以原位雜交探針容易滲透到組織中去，容易成功，而且得到的顏色形態(tài)都較冰凍切片好。3、在什么情況下使用、在什么情況下使用TritonX100（2）DAB顯色時間很短（如幾秒或幾十秒）就出現(xiàn)很深的棕褐色，這很可能說明你的抗體濃度過高或抗體孵育時間過長，需要下調抗體濃度或縮短你的抗體孵育時間；（3）此外，若很短時間就出現(xiàn)背景很深，還有可能你前面的封閉非特異性蛋白不全，需要延長封閉時間；（4）DAB顯色時間很長（

6、如超過十幾分鐘）才出現(xiàn)陽性染色，一方面可能說明你的抗體濃度過低或孵育時間過短（最好一抗4度過夜）；另一方面就是封閉時間過長。8、免疫組化結果如何分析？、免疫組化結果如何分析？（1）陽性著色細胞計數法。在40光鏡下，隨機選擇不重疊的10個視野，人工或機器計數陽性著色細胞，每組3~6張不同動物組織切片，然后進行組間比較即可。（2）灰密度分析法。通過在不同組別和不同動物組織切片上選擇相同區(qū)域、相同條件下用imagej進行灰密度分析，然后進行統(tǒng)

7、計分析即可。（3）評分法。通過在光學顯微鏡下對組織切片分別按染色程度（0~3分為陰性著色、淡黃色、淺褐色、深褐色）、陽性范圍進行評分（1~4分為0~25%、26~50%、51~75%、76~100%），最終可以分數相加，再進行比較。對于以上這幾種方法，各有利弊，請細心選擇。要想得到正確結果的前提是你要做出著色均勻、背景很淺的高質量切片。9、在什么情況下進行組織抗原修復，抗原修復的條件是什么？、在什么情況下進行組織抗原修復，抗原修復的條件

8、是什么？（1）由于組織中部分抗原在甲醛或多聚甲醛固定過程中，發(fā)生了蛋白之間交聯(lián)及醛基的封閉作用，從而失去抗原性。通過抗原修復，使得細胞內抗原決定族重新暴露，提高抗原檢測率。（2）修復方法從強到弱一般分為三種，高壓修復、微波修復、胰酶修復。修復液也分為若干種（具體的可以查閱相關資料，大量的：中性的、高pH的等）。（3）微波修復，我們一般用6min4次，效果不錯。10、內源性過氧化物酶的滅活時間和濃度是什么？、內源性過氧化物酶的滅活時間和濃