免疫組化相關(guān)步驟

1、免疫組化操作步驟免疫組化操作步驟（一）（一）、儀器設(shè)備、儀器設(shè)備1.18cm不銹鋼高壓鍋或電爐或用微波爐不銹鋼高壓鍋或電爐或用微波爐.2.水浴鍋水浴鍋（二）（二）、試、試劑1.PBS緩沖液（緩沖液（ph7.2―7.4）：）：NaC137mmolL，KCl2.7mmolLNa2HPO44.3mmolLKH2PO41.4mmolL.20.01molL檸檬酸鈉緩沖液（檸檬酸鈉緩沖液（CBph6.01000ml）：檸檬酸三鈉）：檸檬酸三鈉3g檸

2、檬酸檸檬酸0.4g。30.5molLEDTA緩沖液（緩沖液（ph8.0）：）：700ml水中溶解水中溶解186.1gEDTA2H2O用10mmolLNaOH調(diào)至調(diào)至ph8.0加水至加水至1000ml.4.1molL的TBS緩沖液（緩沖液（ph8.0）：在）：在800ml水中溶解水中溶解121gTris堿，用堿，用1N的HCl調(diào)至調(diào)至ph8.0加水加水1000ml。5.酶消化液：酶消化液：a.0.1%胰蛋白酶：用胰蛋白酶：用0.1%CaC

3、l12(ph7.8)配制。配制。b.0.4%胃蛋白酶液：胃蛋白酶液：用0.1N的HCl配制。配制。6.3%甲醇甲醇―H2O2溶液：用溶液：用30%H2O2和80%甲醇溶液配制甲醇溶液配制7.風(fēng)裱劑：風(fēng)裱劑：a.甘油和甘油和0.5mmolL碳酸鹽緩沖液（碳酸鹽緩沖液（ph9.0–9.5）等量混合）等量混合b油和油和TBS(PBS)配制配制8TBSPBSPH9.0–9.5適用于熒光纖維鏡標(biāo)本適用于熒光纖維鏡標(biāo)本ph7.07.4適合光學(xué)纖維標(biāo)

4、本適合光學(xué)纖維標(biāo)本（三）（三）、操作流程、操作流程1、脫蠟和水化：脫蠟前應(yīng)將組織芯片在室溫中放置、脫蠟和水化：脫蠟前應(yīng)將組織芯片在室溫中放置60分鐘或分鐘或60℃恒溫箱中烘烤恒溫箱中烘烤20分鐘。分鐘。a組織芯片置于二甲苯中浸泡組織芯片置于二甲苯中浸泡10分鐘分鐘更換二甲苯后在浸泡更換二甲苯后在浸泡10分鐘分鐘b無水乙醇中浸泡五分鐘無水乙醇中浸泡五分鐘c95%乙醇中浸泡五分鐘乙醇中浸泡五分鐘d75%乙醇中浸泡五分鐘乙醇中浸泡五分鐘2、抗

5、原修復(fù)：用于福爾馬林固定的石蠟包埋組織芯片：、抗原修復(fù)：用于福爾馬林固定的石蠟包埋組織芯片：A抗原熱修復(fù)抗原熱修復(fù)a高壓熱修復(fù)高壓熱修復(fù)在沸水中加入在沸水中加入EDTA(ph8.0)或0.01m枸櫞酸鈉緩沖溶液（枸櫞酸鈉緩沖溶液（ph6.0）.蓋上不銹鋼鍋蓋，但不能鎖定。將玻片置于金蓋上不銹鋼鍋蓋，但不能鎖定。將玻片置于金屬染色加上，緩慢加壓，是玻片在緩沖液中浸泡五分鐘，然后將蓋子鎖定，小閥門將會升起來。屬染色加上，緩慢加壓，是玻片在緩

6、沖液中浸泡五分鐘，然后將蓋子鎖定，小閥門將會升起來。10分鐘后除去熱源，置入涼水中，分鐘后除去熱源，置入涼水中，當(dāng)小閥門沉下去后打開蓋子。此方法適用于較難檢測或核抗原的抗原修復(fù)。當(dāng)小閥門沉下去后打開蓋子。此方法適用于較難檢測或核抗原的抗原修復(fù)。b沸熱修復(fù)沸熱修復(fù)電爐或水浴鍋加熱電爐或水浴鍋加熱0.01枸櫞酸鈉緩沖液（枸櫞酸鈉緩沖液（ph6.0）至）至95℃左右，放入組織芯片加熱左右，放入組織芯片加熱1015分鐘。分鐘。c微波爐加熱微波爐

7、加熱在微波爐里加熱在微波爐里加熱0.01枸櫞酸鈉緩沖液（枸櫞酸鈉緩沖液（ph6.0）至沸騰后將組織芯片放入，斷電，間隔）至沸騰后將組織芯片放入，斷電，間隔510分鐘，反復(fù)分鐘，反復(fù)12次。次。適用的抗原適用的抗原Bcl2.Bax.AR.PR.Cfos.xjum.zkit.cmyc.Ecadherin.ChromograninA.Cyclin.ER.Heatshock.Protein.HPV.Ki67.MDMZ.P53.P34.P15.P

8、glycoprotein.PKC.PCNA.ras.Rb.等B酶消化方法酶消化方法常用常用0.1%胰蛋白酶和胰蛋白酶和0.4%胃蛋白酶液。胰蛋白酶使用前預(yù)熱胃蛋白酶液。胰蛋白酶使用前預(yù)熱37℃，消化時間約為，消化時間約為530分鐘。適用于被固定遮分鐘。適用于被固定遮蔽的抗原：包括蔽的抗原：包括Collagen.GFAP.Complement.Cytokeratin.CerB2.LCA.LN.等3、免疫組化染色、免疫組化染色SP法（1）脫

9、蠟、水化脫蠟、水化（2）PBS洗23次各次各5分鐘分鐘（3）3%H2O2(80%甲醇甲醇)滴加在滴加在TMA上，室溫靜置上，室溫靜置10分鐘分鐘（4）PBS洗23次各次各5分鐘分鐘（5）抗原修復(fù)）抗原修復(fù)（6）PBS洗23次各次各5分鐘分鐘（7）滴加正常山羊血清封閉液，室溫）滴加正常山羊血清封閉液，室溫20分鐘，甩去多余液體分鐘，甩去多余液體（8）滴加）滴加Ι抗50μl室溫靜置室溫靜置1小時或小時或4℃過夜或過夜或37℃1小時小時（9）

10、4℃過夜后需在過夜后需在37℃復(fù)溫復(fù)溫45分鐘分鐘（10）PBS洗3次每次次每次2分鐘分鐘（11）滴加）滴加Ⅱ抗4550μl室溫靜置或室溫靜置或37℃1小時小時（12）Ⅱ抗中可加入抗中可加入0.05%的tween20.（13）PBS洗3次各次各5分鐘分鐘（14）DAB顯色顯色510分鐘，在顯微鏡下掌握染色程度分鐘，在顯微鏡下掌握染色程度（15）PBS或自來水沖洗或自來水沖洗10分鐘分鐘（16）蘇木精復(fù)染）蘇木精復(fù)染2分鐘，鹽酸酒精分化分

11、鐘，鹽酸酒精分化（3）切片時展片：有些組織在切片后難以在水中展開，這時可適當(dāng)?shù)卦谒屑尤霂椎我掖肌＃┣衅瑫r展片：有些組織在切片后難以在水中展開，這時可適當(dāng)?shù)卦谒屑尤霂椎我掖肌＃?）烤片：）烤片：60℃60℃3030分鐘或分鐘或37℃37℃過夜，溫度太高或時間太長，抗原容易丟失。過夜，溫度太高或時間太長，抗原容易丟失。（5）蠟塊及切片的保存：最好在）蠟塊及切片的保存：最好在4℃4℃保存保存（6）脫片問題：）脫片問題：PolyLLysin

12、e(PolyLLysine(多聚賴氨酸多聚賴氨酸)為目前免疫組化染色工作中最常用的一種防脫片劑，為目前免疫組化染色工作中最常用的一種防脫片劑，6ml6ml的多聚賴氨酸溶液可按的多聚賴氨酸溶液可按1:101:10稀釋成稀釋成60ml60ml的工作液，適合于需要酶消化、微波、高溫高壓的防脫片處理。如不行，可用雙重處理（的工作液，適合于需要酶消化、微波、高溫高壓的防脫片處理。如不行，可用雙重處理（APESAPES和PolyLLysinePol

13、yLLysine）的切片。）的切片。在以上兩種條件都行不通的情況下，可用如下方法：切片在脫蠟前，放在在以上兩種條件都行不通的情況下，可用如下方法：切片在脫蠟前，放在APESAPES1：5050丙酮溶液中浸泡丙酮溶液中浸泡3分鐘，晾干，即可進(jìn)行分鐘，晾干，即可進(jìn)行下一步。下一步。（7）滅活內(nèi)源性酶：）滅活內(nèi)源性酶：HRPHRP系統(tǒng)：系統(tǒng)：3%3%雙氧水滅活；雙氧水滅活；APAP系統(tǒng)：系統(tǒng)：3%HAc3%HAc滅活。滅活。（8）暴露抗原：對

14、于石蠟切片的免疫組化實驗時，必須采用高溫加熱抗原修復(fù)，這將有助于暴露抗原決定簇，從而增加免疫）暴露抗原：對于石蠟切片的免疫組化實驗時，必須采用高溫加熱抗原修復(fù)，這將有助于暴露抗原決定簇，從而增加免疫組化染色的強度組化染色的強度(不同抗體的最佳修復(fù)液請參閱抗體說明書不同抗體的最佳修復(fù)液請參閱抗體說明書)。對于不同的組織，不同的抗原，不同的抗體，所采用的方法應(yīng)不一。對于不同的組織，不同的抗原，不同的抗體，所采用的方法應(yīng)不一樣，可進(jìn)行熱修復(fù)、

15、胰酶消化、既不修復(fù)也不消化。膠原還可以用胃蛋白酶消化等。樣，可進(jìn)行熱修復(fù)、胰酶消化、既不修復(fù)也不消化。膠原還可以用胃蛋白酶消化等。（9）封閉：在山羊血清封閉，非特異性染色仍然較強時，可延長封閉時間或用濃縮血清封閉）封閉：在山羊血清封閉，非特異性染色仍然較強時，可延長封閉時間或用濃縮血清封閉（1010）抗體稀釋：應(yīng)遵循）抗體稀釋：應(yīng)遵循“現(xiàn)用現(xiàn)配現(xiàn)用現(xiàn)配”的原則，對于的原則，對于PBSPBS稀釋的抗體一定要當(dāng)天使用。稀釋的抗體一定要當(dāng)天使

16、用。（1111）背景高：在抗體濃度、反應(yīng)時間、反應(yīng)溫度等合適的條件下，如果背景依舊高，可采用含）背景高：在抗體濃度、反應(yīng)時間、反應(yīng)溫度等合適的條件下，如果背景依舊高，可采用含1‰1‰Tween20Tween20的PBSPBS洗，特洗，特別是在顯色之前要多洗。別是在顯色之前要多洗。（1212）返藍(lán)：在蘇木素復(fù)染后，可用堿性緩沖液（如）返藍(lán)：在蘇木素復(fù)染后，可用堿性緩沖液（如PBSPBS）或）或Na2HPO4Na2HPO4的飽和溶液返藍(lán)。的

17、飽和溶液返藍(lán)。（1313）顯色：一定要在顯微鏡下觀察，注意控制背景。）顯色：一定要在顯微鏡下觀察，注意控制背景。（1414）在整個操作過程中，切片千萬不能干燥，否則會有非特異性染色。）在整個操作過程中，切片千萬不能干燥，否則會有非特異性染色。（1515）拍照）拍照1)1)更換樣品時，除了調(diào)整焦距和視野外，顯微鏡上的其他部件都不能動！所有的樣品必須一次拍攝完全。特別是在拍攝過程更換樣品時，除了調(diào)整焦距和視野外，顯微鏡上的其他部件都不能動！

18、所有的樣品必須一次拍攝完全。特別是在拍攝過程中，不要一會用高倍鏡，一會用低倍鏡，來回切換物鏡。中，不要一會用高倍鏡，一會用低倍鏡，來回切換物鏡。2)2)數(shù)碼相機必須設(shè)置為手動曝光，并且保持每張照片用同樣的曝光條件，同樣的曝光時間，同樣的光圈。特別要注意的是，數(shù)碼相機必須設(shè)置為手動曝光，并且保持每張照片用同樣的曝光條件，同樣的曝光時間，同樣的光圈。特別要注意的是，一定要將數(shù)碼相機的自動白平衡功能給關(guān)掉一定要將數(shù)碼相機的自動白平衡功能給關(guān)掉

19、3)3)免疫組化切片一般染色不太深，因此拍攝出的照片顏色較淺，就讓它淺。拍攝出的照片中空白部位應(yīng)盡可能呈現(xiàn)純白色。免疫組化切片一般染色不太深，因此拍攝出的照片顏色較淺，就讓它淺。拍攝出的照片中空白部位應(yīng)盡可能呈現(xiàn)純白色。測量其灰度應(yīng)在測量其灰度應(yīng)在250250左右。如果呈現(xiàn)淡藍(lán)色，一般是相機自動白平衡在起作用。另外一個因素是顯微鏡燈光電壓不正確。要使燈左右。如果呈現(xiàn)淡藍(lán)色，一般是相機自動白平衡在起作用。另外一個因素是顯微鏡燈光電壓不正確

20、。要使燈光本身的色溫正確。既不偏黃，也不偏藍(lán)。光本身的色溫正確。既不偏黃，也不偏藍(lán)。免疫組化技術(shù)的關(guān)鍵問題免疫組化技術(shù)的關(guān)鍵問題1.1.組織處理組織處理恰當(dāng)?shù)慕M織處理是做好免疫組化染色的先決條件，也是決定染色成敗的內(nèi)部因素，在組織細(xì)胞材料準(zhǔn)備的過程中，不僅要求恰當(dāng)?shù)慕M織處理是做好免疫組化染色的先決條件，也是決定染色成敗的內(nèi)部因素，在組織細(xì)胞材料準(zhǔn)備的過程中，不僅要求保持組織細(xì)胞形態(tài)完整，更要保持組織細(xì)胞的抗原性不受損或彌漫，防止組織自溶

21、。如果出現(xiàn)自溶壞死的組織，抗原已經(jīng)丟失，保持組織細(xì)胞形態(tài)完整，更要保持組織細(xì)胞的抗原性不受損或彌漫，防止組織自溶。如果出現(xiàn)自溶壞死的組織，抗原已經(jīng)丟失，即使用很靈敏的檢測抗體和高超的技術(shù)，也很難檢出所需的抗原，反而往往由于組織的壞死或制片時的刀痕擠壓，在上述區(qū)域易即使用很靈敏的檢測抗體和高超的技術(shù)，也很難檢出所需的抗原，反而往往由于組織的壞死或制片時的刀痕擠壓，在上述區(qū)域易出現(xiàn)假陽性結(jié)果。出現(xiàn)假陽性結(jié)果。1)1)組織及時取材和固定組織及

22、時取材和固定組織標(biāo)本及時的取材和固定是做好免疫組化染色的關(guān)鍵第一步，是有效防止組織自溶壞死，抗原丟失的開始，離體組織應(yīng)盡組織標(biāo)本及時的取材和固定是做好免疫組化染色的關(guān)鍵第一步，是有效防止組織自溶壞死，抗原丟失的開始，離體組織應(yīng)盡快的進(jìn)行取材，最好快的進(jìn)行取材，最好2h2h內(nèi)，取材時所用的刀應(yīng)銳利，要一刀下去切開組織，不可反復(fù)切拉組織，造成組織的擠壓，組織塊大小要內(nèi)，取材時所用的刀應(yīng)銳利，要一刀下去切開組織，不可反復(fù)切拉組織，造成組織的擠

23、壓，組織塊大小要適中，一般在適中，一般在2.5cm2.5cm0.2cm2.5cm2.5cm0.2cm，切記取材時組織塊寧可面積大，千萬不能厚的原則，，切記取材時組織塊寧可面積大，千萬不能厚的原則，(也就是說組織塊的面積可以大到也就是說組織塊的面積可以大到3cm5cm3cm5cm，但組織塊的厚度千萬不能超過，但組織塊的厚度千萬不能超過0.2cm0.2cm，否則將不利于組織的均勻固定，否則將不利于組織的均勻固定)。固定液快速滲透到組織內(nèi)部使

24、組織蛋白能在一。固定液快速滲透到組織內(nèi)部使組織蛋白能在一定時間內(nèi)迅速凝固。從而完好的保存抗原和組織細(xì)胞形態(tài)。定時間內(nèi)迅速凝固。從而完好的保存抗原和組織細(xì)胞形態(tài)。對于固定液的選擇，原則上講，應(yīng)根據(jù)抗原的耐受性來選擇相應(yīng)的固定液，但除非是專項科研項目，在病理常規(guī)工作很難做對于固定液的選擇，原則上講，應(yīng)根據(jù)抗原的耐受性來選擇相應(yīng)的固定液，但除非是專項科研項目，在病理常規(guī)工作很難做到這一點，因為病理的診斷和鑒別診斷都是在常規(guī)到這一點，因為病理的

25、診斷和鑒別診斷都是在常規(guī)HEHE病理診斷的基礎(chǔ)上決定是否進(jìn)行免疫組化的染色，而病理診斷的基礎(chǔ)上決定是否進(jìn)行免疫組化的染色，而HEHE染色的常規(guī)組織處染色的常規(guī)組織處理是采用理是采用10%10%的中性緩沖福爾馬林或的中性緩沖福爾馬林或4%4%緩沖多聚甲醛緩沖多聚甲醛4倍于組織體積進(jìn)行組織固定，利用其滲透性強，對組織的作用均勻進(jìn)行固倍于組織體積進(jìn)行組織固定，利用其滲透性強，對組織的作用均勻進(jìn)行固定，但組織固定時間最好在定，但組織固定時間最好

26、在l2hl2h內(nèi)，一般固定時間不應(yīng)超過內(nèi)，一般固定時間不應(yīng)超過2424小時。隨著固定時間的延長對組織抗原的檢出強度將逐漸降低。小時。隨著固定時間的延長對組織抗原的檢出強度將逐漸降低。2)2)組織脫水、透明、浸蠟組織脫水、透明、浸蠟組織經(jīng)固定后進(jìn)行脫水、透明、浸蠟和包埋。掌握的原則是脫水透明要充分但不能過，浸蠟時間要夠，溫度不能高，否則造組織經(jīng)固定后進(jìn)行脫水、透明、浸蠟和包埋。掌握的原則是脫水透明要充分但不能過，浸蠟時間要夠，溫度不能高，