免疫組化相關(guān)問題-個人總結(jié)

1、免疫組化步驟免疫組化步驟一般的sp法步驟啊，具體如下：1、烤片，68℃，20分鐘，2.脫蠟：依次將載玻片放入二甲苯二甲苯100%酒精100%酒精95%酒精90%酒精80%酒精70%酒精，起脫蠟作用的主要是二甲苯依據(jù)的是相似相溶的原理.一般在每個試劑中放10min天氣熱可以少放幾分鐘相反天氣較冷的話就要適當延長脫蠟時間一般為1215min.3.抗原修復：脫蠟后在清水中沖洗一段時間，加入3%H2O2甲醇溶液浸泡10min，從而除去內(nèi)源性的過

2、氧化氫酶，然后倒掉H2O2，在清水中洗兩次，再加入檸檬酸緩沖液，放入微波爐中蒸煮3min（中火），一般剛到沸騰即可，冷卻至室溫，然后再蒸煮一次，冷卻至室溫，蒸煮的目的是為了使抗原的位點暴露出來。4.血清封閉：冷卻至室溫后，將檸檬酸緩沖液倒掉，水洗2次，并將載玻片置于PBS中5min，洗2次，擦干組織周圍的PBS液，馬上加上血清，使一些非特異性的位點封閉起來，然后放入37C溫箱中半小時。血清稀釋10倍（900lPBS：100l血清封閉液）

3、。5.加一抗：將溫箱中的載玻片取出，用吸水紙擦干載玻片反面和正面組織周圍的血清，不洗，加一抗，如果做對照實驗，就在對照的組織上加PBS。加完一抗后于4C冰箱中保存過夜(≥18h)。6.加二抗：將載玻片從冰箱中取出，4℃過夜后在37℃復溫45分鐘，放入PBS中洗3次，每次5min，擦干組織周圍的PBS后加上二抗然后置于37C溫箱中半小時。7.加SABC:將片子從溫箱中取出放入PBS中洗3次，每次5min，擦干組織周圍的PBS后加上SABC

4、然后置于37C溫箱中半小時。SABC稀釋100倍（990lPBS：10lSABC）。8.加顯色劑：將片子從溫箱中取出放入PBS中洗3次，每次5min，擦干組織周圍的PBS后加上顯色劑。（顯色劑的配置：在1ml水中加1滴顯色劑A，搖勻，然后加1滴顯色劑B，搖勻，再加1滴顯色劑C，搖勻）A：DABB：H2O2C：磷酸緩沖液9.復染：將顯色后的片子用清水沖洗一段時間后，浸泡于蘇木精中染色，一般動物組織為半分鐘，植物組織35min。然后鹽酸酒精

5、分化。10.脫水：將復染后的片子置于水中沖洗后，依次將載玻片放入70%酒精80%酒精90%酒精95%酒精100%酒精100%酒精二甲苯二甲苯。每個試劑中放置2min，最后浸泡在二甲苯中，搬到通風柜中。11.封片：用中性樹膠滴在組織旁邊，再用蓋玻片蓋上，要先放平一側(cè)，然后輕輕放下另一側(cè)，以免產(chǎn)生氣泡，封好片子后置于通風柜中晾干。免疫組化技術(shù)要點免疫組化技術(shù)要點1.固定固定最好用4%的多聚甲醛固定液。對于冰凍切片，甲醛固定有時比冰凍丙酮好；

6、但對于不同的組織和抗原，可選用不同的固定液。有時候商品化的抗體會有比較適合而推薦的固定液，請于購置前注意說明書。（1）BouinS固定液：飽和苦味酸750ml，甲醛250ml，冰醋酸50ml，其對組織的穿透力較強，固定較好，結(jié)構(gòu)完整，但因偏酸，對抗原有一定損害，且組織收縮明顯，不適于組織標本的長期保存。（2）PLP液：即高碘酸鈉賴氨酸多聚甲醛，適于固定石蠟切片。適于富含糖類組織，對超微結(jié)構(gòu)及許多抗原的抗原性保存較好。2.微波中高火68m

7、in。3.室溫冷卻。4.用PBS洗滌3次，每次5min。二、蛋白酶蛋白酶K法1.配制新鮮溶液：25μl20mgml蛋白酶K；2.5ml1MTrisHCl（pH8.0）；0.5ml0.5MEDTA（pH8.0）；加水定容到加水定容到50ml。2.37℃下，將玻片放在架子上孵育5min（蛋白酶K不要預熱）。3.用PBS洗滌3次，每次5min。三、尿素法尿素法1.把玻片放在玻璃固定架上，再將架子放在盛有600ml的1M尿素（新鮮配制）的容器中

8、。2.微波10min，20min或者30min，每5min補充一次蒸發(fā)掉的水。3.冷卻30min到1h。4.用蒸餾水洗滌4次，每次3min再用PBS洗滌3min。免疫組化免疫組化SP法步驟法步驟1.烤片，68℃，20分鐘2.常規(guī)二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水；二甲苯I20min二甲苯II20min100%酒精I10min100%II10min95%5min80%5min70%5min3.阻斷滅活內(nèi)源性過氧化物酶：3%H2O237℃孵育10mi

9、n，PBS沖洗3X5min；4.抗原修復:置0.01M枸櫞酸緩沖液（PH6.0）中用煮沸（95℃，15－20min），自然冷卻20min以上，再用冷水沖洗缸子，加快冷卻至室溫，PBS沖洗3X5min。5.正常羊血清工作液封閉，37℃10min，傾去勿洗.6.滴加一抗4℃冰箱孵育過夜，PBS沖洗3X5min（用PBS緩沖液代替一抗作陰性對照）；滴加生物素標記二抗37℃孵育30minPBS沖洗3X5min7.滴加辣根過氧化物酶標記的鏈霉素卵

10、白素工作液，37℃孵育30minPBS沖洗3X5min8.DABH2O2反應(yīng)染色，自來水充分沖洗后，蘇木素復染，常規(guī)脫水，透明，干燥，封片。SP法1）脫蠟、水化；2）PBS洗2～3次各5分鐘；3）3%H2O2（80%甲醇）滴加在TMA上，室溫靜置10分鐘；4）PBS洗2～3次各5分鐘；5）抗原修復；6）PBS洗2～3次各5分鐘；7）滴加正常山羊血清封閉液室溫20分鐘。甩去多余液體。8）滴加Ⅰ抗50μl，室溫靜置1小時或者4℃過夜或者37