實(shí)驗(yàn)九dna的粗提取與鑒定

1、1【實(shí)驗(yàn)九實(shí)驗(yàn)九】DNA】DNA的粗提取與鑒定的粗提取與鑒定陳小陳小珺（江西?。ń魇≮M州市第三中學(xué)贛州市第三中學(xué)341000341000）1教學(xué)建議教學(xué)建議在本實(shí)驗(yàn)的教學(xué)中，教師應(yīng)注意以下幾點(diǎn)。1.1實(shí)驗(yàn)材料必須準(zhǔn)備充足。本實(shí)驗(yàn)所用的實(shí)驗(yàn)材料是雞血細(xì)胞液由活雞的鮮血經(jīng)沉淀后獲得。每組(2個(gè)學(xué)生)需用5mL雞血細(xì)胞液則每班(50人)至少需要130mL而雞血細(xì)胞液與雞血的體積比為1:3這樣每班至少需要390mL雞血細(xì)胞液。宰殺1只中等大小

2、的活雞一般可得120mL左右的鮮血因此1個(gè)班實(shí)驗(yàn)需要買(mǎi)4只活雞。也可以到市場(chǎng)售活雞處去索取雞血但所帶燒杯中必須提前放入抗凝劑。（每100ml雞血加入3g檸檬酸鈉）1.2盛放雞血細(xì)胞液的容器最好是塑料容器。因?yàn)殡u血細(xì)胞破碎后釋放出的DNA容易被玻璃容器吸附由于細(xì)胞內(nèi)DNA的含量本來(lái)就比較少再被玻璃容器吸附去一部分提取到的DNA就會(huì)更少。1.3獲取較純凈的DNA的關(guān)鍵步驟。1.3.1充分?jǐn)嚢桦u血細(xì)胞液：將雞血細(xì)胞液與蒸餾水混合以后必須用玻璃

3、棒沿一個(gè)方向快速攪拌使雞血細(xì)胞加速破裂并釋放出DNA。1.3.2沉淀DNA時(shí)必須用冷酒精：體積分?jǐn)?shù)為95%的酒精在冰箱中至少存放24h。1.3.3正確攪拌含有懸浮物的溶液實(shí)驗(yàn)步驟3、5、7都需要用玻璃棒攪拌。教師應(yīng)提醒學(xué)生注意在進(jìn)行步驟3、5時(shí)玻璃棒不要直插燒杯底部而且攪拌要輕緩以便獲得較完整的DNA分子。進(jìn)行步驟7時(shí)要將玻璃棒插入燒杯中溶液的中間用手緩慢轉(zhuǎn)動(dòng)5min。2實(shí)驗(yàn)原理的補(bǔ)充介紹實(shí)驗(yàn)原理的補(bǔ)充介紹2.1DNA的釋放本實(shí)驗(yàn)用雞血

4、細(xì)胞做實(shí)驗(yàn)材料有兩個(gè)原因。一是因?yàn)殡u血細(xì)胞核的DNA含量豐富，材料易得；二是雞血細(xì)胞極易吸水脹破。DNA位于雞血細(xì)胞的細(xì)胞核中正常情況下不會(huì)釋放出來(lái)。為了使DNA從細(xì)胞核中釋放出來(lái)實(shí)驗(yàn)中采用了向雞血細(xì)胞液中加入蒸餾水并且攪拌的方法。蒸餾水對(duì)于雞血細(xì)胞來(lái)說(shuō)是一種低滲液體水分可以大量進(jìn)入血細(xì)胞內(nèi)使血細(xì)胞破裂。同時(shí)再加上攪拌的機(jī)械作用就加速了雞血細(xì)胞的破裂(細(xì)胞膜和核膜的破裂)于是釋放出DNA當(dāng)然也有RNA。但是釋放出來(lái)的大量DNA和RNA往

5、往與蛋白質(zhì)結(jié)合在一起。2.2將DNA與蛋白質(zhì)分離根據(jù)二者的特性即在濃度較高的氯化鈉溶液(物質(zhì)的量濃度為2moLL)中核蛋白容易解聚游離出DNA。而DNA在濃度較高的氯化鈉溶液中的溶解度很高Na與帶負(fù)電的DNA結(jié)合成DNA鈉鹽。這時(shí)DNA在溶液中呈溶解狀態(tài)。2.3DNA的析出與獲取利用DNA在濃度較低的氯化鈉溶液中溶解度小的原理向含有DNA的濃度較高的氯化鈉溶液中加入大量(300mL)蒸餾水稀釋氯化鈉溶液使DNA的溶解度下降而蛋白質(zhì)的溶解

6、度增高(這就是蛋白質(zhì)的鹽溶現(xiàn)象)從而使二者分離。這時(shí)加上不停地?cái)嚢枞芙舛认陆档腄NA逐漸呈絲狀物。再通過(guò)過(guò)濾濾去蛋白質(zhì)就可以獲取DNA的黏稠物了。如果采用離心法則更好用4000rmin的旋轉(zhuǎn)頻率離心15min除去上清液(含有蛋白質(zhì))留下的沉淀物中含DNA。2.4DNA的再溶解再用較高濃度的氯化鈉溶液去溶解DNA黏稠物。3洗滌劑等去污劑可以溶解細(xì)胞的細(xì)胞壁，破壞細(xì)胞膜，同時(shí)也能使蛋白質(zhì)變性。當(dāng)細(xì)胞壁破壞后，細(xì)胞釋放出核酸與蛋白質(zhì)形成的復(fù)合

7、物——核糖核蛋白(RNP)和脫氧核糖核蛋白(DNP)，這兩種復(fù)合物在不同電解質(zhì)溶液中的溶解度有較大差異。當(dāng)NaCl濃度達(dá)到0.14mol／L時(shí)，DNP溶解度約為純水中溶解度的1％，但RNP則不一樣，在0.14mol／LNaCl溶液中，DNP溶解度很低，而RNP的溶解度仍相當(dāng)大，因此在制備DNA時(shí)，利用0.14mol／L稀鹽溶液使DNP與RNP分開(kāi)。去除蛋白質(zhì)后的核酸鹽溶液，再利用其不溶于有機(jī)溶劑的性質(zhì)，但細(xì)胞中的其他物質(zhì)則可以溶于有機(jī)溶

8、劑，應(yīng)用適當(dāng)濃度的有機(jī)溶劑(如乙醇)使DNA呈絮狀沉淀析出（本實(shí)驗(yàn)加入酒精后使食鹽濃度接近0.14molL）。在溶液中，DNA鏈略帶負(fù)電荷，而鹽離子可被吸引到DNA的負(fù)電荷上，中和這些負(fù)電荷，因此就能夠使DNA片段聚合在一起，形成絮狀粘稠物質(zhì)。利用這一原理，就可以用酒精萃取DNA。DNA與二苯胺作用生成藍(lán)色沉淀用來(lái)鑒定DNA。二.材料：洋蔥、洗潔精、食鹽、95％酒精、蒸餾水、0.015mol／L的NaCl溶液：稱(chēng)取0.88gNaCl，投

9、入1000ml容量瓶中，加水到所需體積的刻度線(xiàn)上，溶解后成0.015mol／L氯化鈉溶液。二苯胺試劑：1g重結(jié)晶的二苯胺溶于100ml冰乙酸（A.R.）中，再加10ml過(guò)氯酸，臨用前加入1.0ml16%的乙醛，試劑應(yīng)為無(wú)色，三.器具：勻漿機(jī)或研缽、紗布、漏斗、燒杯、玻璃棒、量筒、滴管、試管、天平。四.方法步驟稱(chēng)取100g洋蔥，切碎，放進(jìn)攪拌機(jī)或研缽中加入100ml洗潔精充分?jǐn)嚢杌蜓心⒀心ヒ河寐┒泛蛢蓪蛹啿歼^(guò)濾到燒杯中加入1g食鹽，攪拌

10、均勻量取上述澄清的洋蔥液50ml加入70ml的95％酒精輕輕搖動(dòng)或用玻璃棒輕輕攪拌白色纖維狀粘稠物質(zhì)析出，即DNA用玻璃棒可將其輕輕卷起，放入1號(hào)試管攪拌溶解后，加入4ml二苯胺試劑混合均勻，在沸水浴中加熱3～8min，觀察顏色的變化。五.實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)1)材料必須充分勻漿或研磨，否則洋蔥細(xì)胞沒(méi)有完全破碎，影響實(shí)驗(yàn)效果；2)加入酒精后搖動(dòng)或攪拌時(shí)一定要輕緩，否則會(huì)破壞DNA，以至于看不到；3)DNA鑒定時(shí)，二苯胺最好現(xiàn)配現(xiàn)用，否則二苯胺會(huì)