質(zhì)粒提取、定量與酶切鑒定

1、質(zhì)粒DNA的提取、定量與酶切鑒定,Extraction and Identification of Plasmid DNA,實驗流程圖,一、堿裂解法提取質(zhì)粒,,三、質(zhì)粒酶切,二、質(zhì)粒定量,四、酶切產(chǎn)物的瓊脂糖電泳檢測,,,最后做,掌握堿裂解法提取質(zhì)粒的方法 掌握紫外吸收測定DNA的方法 了解質(zhì)粒酶切鑒定原理 掌握瓊脂糖凝膠電泳技術(shù),實驗?zāi)康?pMD18-T,,,,,實驗材料,大腸桿菌DH5a菌株pMD18-T載體Ax

2、ygen質(zhì)粒小量提取試劑盒,Takara EcoRI 限制性內(nèi)切酶Takara Hind III 限制性內(nèi)切酶Takara 10 × M 酶切緩沖液,BioWest電泳瓊脂糖干粉0.5×TBE核酸電泳緩沖液EB 核酸熒光染料Takara 6 × 電泳上樣緩沖液,,,實驗儀器,微量移液器離心機(jī)恒溫水浴箱紫外檢測儀電泳儀水平電泳槽,獨(dú)立于細(xì)菌染色體以外，能獨(dú)立自主復(fù)制的閉合環(huán)狀DNA分子

3、基因工程常采用的載體,一、堿裂解法提取質(zhì)粒DNA,堿裂解法；煮沸裂解；羥基磷灰石柱層析法；質(zhì)粒DNA釋放法；酸酚法等,質(zhì)粒提取方法：,堿裂解法基本原理,基于染色體DNA與質(zhì)粒DNA的變性與復(fù)性的 差異而達(dá)到分離目的。,染色體DNA：氫鍵斷裂，變性。質(zhì)粒DNA：大部分氫鍵斷裂，但超螺旋共價閉合環(huán)狀的兩條互補(bǔ)鏈不會完全分離。（不完全變性）,質(zhì)粒DNA

4、：復(fù)性，溶于溶液中染色體DNA：不能復(fù)性；形成纏連的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。,,pH =12.6（堿性）,NaAc溶液 （pH4.8）,pH=中性,染色體DNA與不穩(wěn)定的大分子RNA、蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物等一起沉淀下來,,離心,pMD18-T,溶液S1（細(xì)菌懸浮液）裂解液S2中和液S3去蛋白液W1漂洗液W2洗脫液RNase A(100mg/ml)DNA吸附柱,試劑盒的組成：,溶液S1： 50 mmol/L　葡萄糖

5、10 mmol/L　EDTA 25 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0) 2毫克/毫升　溶菌酶裂解液S2：200 mmol/L NaOH 1% SDS中和液S3： 3 mol/L KAc (pH4.8)溶液,實驗流程,1.5mL 菌液,12000rpm,1 min,菌體沉淀,溶液S1,250μl,劇烈震蕩,裂解液S2,250μl,顛倒混勻4-6次,中和液S

6、3,350μl,溫和地顛倒混勻6-8次,12，000rpm10 min,室溫靜置2min,至出現(xiàn)白色絮狀沉淀,取700μl上清至吸附柱管,12，000rpm30s,12，000rpm30s,漂洗液W2,600μl,12，000rpm30s,12，000rpm2 min,取吸附柱至另一新EP管,洗脫液Eluent,50μl,12，000rpm1 min,室溫靜置1min,棄濾液空柱,收集洗脫液備用,去蛋白液W1,600

7、μl,棄濾液,棄濾液,2. 懸浮細(xì)胞,1. 收集細(xì)胞,3. 裂解細(xì)胞,4. 中和,6. 洗柱,7. 洗脫,5. 過柱分離,二、質(zhì)粒DNA定量測定,利用核酸在260nm處有紫外吸收的特性,基本原理,紫外分光光度計,操作步驟,取5?l提取的質(zhì)粒DNA，加入95?l蒸餾水 混合均勻3. 用紫外分光光度計測定A260,DNA或RNA的定量A260=1.0相當(dāng)于 50μg/ml雙鏈DNA 40μg

8、/ml單鏈DNA（或RNA） 20μg/ml寡核苷酸,紫外光吸收法：,DNA純品: OD260/OD280 = 1.8RNA純品: OD260/OD280 = 2.0,DNA或RNA的純度判定,數(shù)據(jù)處理,,Ratio值A(chǔ)260/A280,三、質(zhì)粒DNA的酶切分析,質(zhì)粒 DNA: ～3 kb 載體: pMD18-T 2.7kb

9、 基因: CHD5 0.4 kb,,,限制酶特異性地結(jié)合于一段被稱為限制酶識別序列的特殊DNA序列之內(nèi)或其附近的特異位點(diǎn)上，并在此切割雙鏈DNA。分子克隆中常用的為II型限制酶，其識別位點(diǎn)長度為4～6個核苷酸的反向重復(fù)序列。,限制性內(nèi)切酶,EcoRⅠ和HindⅢ的識別序列和切口是：  EcoRⅠ：G↓AATTC  HindⅢ：A↓AGCTT,pMD18-T,,

10、,,,在一個潔凈的1.5 ml離心管中混勻下列反應(yīng)物：,混合后37 ℃水浴1～2h,質(zhì)粒DNA的酶切分析操作,,影響酶切反應(yīng)的因素,底物DNA的純度反應(yīng)系統(tǒng)：(反應(yīng)緩沖液)反應(yīng)體積： 甘油濃度<5%保溫時間與溫度,四、瓊脂糖凝膠電泳,瓊脂糖凝膠,瓊脂糖（Agarose ）是一種多聚糖，由半乳糖及其衍生物構(gòu)成的中性物質(zhì)，不帶電荷。瓊脂糖透明無紫外吸收，因此，目前多用瓊脂糖為電泳支持物進(jìn)行平板電泳。,電泳：帶電粒子在電場中泳動的

11、現(xiàn)象,影響遷移率的因素？,電場,樣品：,大?。ǚ肿恿浚┬螤睿?gòu)型）電荷,共價閉環(huán)超螺旋DNA＞線性DNA＞開環(huán)的雙鏈環(huán)狀DNA,質(zhì)粒DNA三種構(gòu)型：共價閉環(huán)超螺旋線性開環(huán)的雙鏈環(huán)狀,本次電泳使用1.0%瓊脂糖凝膠,瓊脂糖凝膠濃度與DNA分子的有效分離范圍,瓊脂糖凝膠的制備上樣：加樣前，樣品先與6×上樣緩沖液混勻電泳 ：電壓100v；30min結(jié)果觀察：凝膠成像儀,瓊脂糖凝膠電泳操作,瓊脂糖凝膠電泳,1. 凝膠

12、準(zhǔn)備 ① 稱1g瓊脂糖置三角瓶中，加0.5×TBE 100ml ； ② 微波爐加熱大約2分鐘，熔化瓊脂糖；2. 膠床準(zhǔn)備 ① 將梳子垂直插入到膠床的小凹槽內(nèi)，梳齒底端和床面有1mm的間隙； ② 將膠床放在調(diào)整好的水平臺上；鋪膠：將冷卻至60℃的凝膠倒入準(zhǔn)備好的膠床內(nèi)，凝膠厚度約5 mm；室溫下靜置凝膠固化。將帶凝膠的膠床置于電泳槽中，并使樣品孔位于電場負(fù)極；,向電泳

13、槽中加入0.5×TBE電泳緩沖液，越過凝膠表面即可；輕輕拔出固定在凝膠中的梳子；樣品準(zhǔn)備：向核酸樣品中加入約為樣品體積1/6的上樣緩沖液，用加樣器輕輕混勻；上樣：用加樣器吸取樣品，輕輕的加入到凝膠的樣品孔中，加樣量為6 µl ；蓋上電泳槽，接通電源，開始電泳； 電泳條件：電壓80v；時間25～30分鐘；電泳結(jié)束后，切斷電源，取出凝膠。電泳結(jié)果分析：紫外檢測儀直接觀察電泳條帶 13. 取出凝膠，置于凝膠

14、成像儀中觀察結(jié)果，并拍照記錄。,瓊脂糖凝膠電泳上樣,1：DNA Marker（ 5 ?l ）2：提取的質(zhì)粒DNA （ 5 ?l ）3：質(zhì)粒DNA酶切產(chǎn)物 （ 10 ?l ）,每組上2個樣品,DNA Marker (ladder),Loading Buffer上樣緩沖液,EDTA甘油 ……………增大溶液密度 溴酚藍(lán)…………指示劑二甲苯胺藍(lán)……指示劑,組成,0.5TBE, 0.5-1.4%濃度的膠中，遷移率

15、 溴酚藍(lán)=300bp 二甲苯胺藍(lán)=4kbp,染色溴化乙錠(Ethidium　Bromide，EB) :3,8-二氨基-5-乙基-6苯基菲啶溴鹽，能插入DNA分子堿基對之間并與之結(jié)合,在紫外光照射下呈現(xiàn)紅橙熒光,優(yōu)點(diǎn)：染色操作簡便，快速；靈敏度高缺點(diǎn)：有致癌性(使用時一定要戴手套),1 2,M,3 4,5 6 7,5000300020