熒光定量pcr之絕對(duì)定量分析——標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

1、熒光定量熒光定量PCR之絕對(duì)定量分析之絕對(duì)定量分析——標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制1.絕對(duì)定量定義絕對(duì)定量是用已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線來(lái)推算未知樣品的量。將標(biāo)準(zhǔn)品稀釋至不同濃度，作為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。以標(biāo)準(zhǔn)品拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，以測(cè)得的CT值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，對(duì)未知樣品進(jìn)行定量時(shí)，根據(jù)未知樣品的CT值，即可在標(biāo)準(zhǔn)曲線中得到樣品的拷貝數(shù)。Log(起始濃度)與循環(huán)數(shù)呈線性關(guān)系，通過(guò)已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，即得到

2、該擴(kuò)增反應(yīng)存在的線性關(guān)系由樣品CT值，就可以計(jì)算出樣品中所含的模板量2.絕對(duì)定量標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)品的一些標(biāo)準(zhǔn)必須用與擴(kuò)增目的基因相同的引物進(jìn)行擴(kuò)增，并且擴(kuò)增效率相同標(biāo)準(zhǔn)品必須是經(jīng)過(guò)準(zhǔn)確定量的（我們通常用的是ASP3700紫外光可見(jiàn)光微量分光光度計(jì)）標(biāo)準(zhǔn)品必須是標(biāo)準(zhǔn)化的（例如，同一化的細(xì)胞數(shù)）在每組實(shí)驗(yàn)時(shí)，必須用相同的閾值設(shè)定來(lái)確定CT值標(biāo)準(zhǔn)品可以是含有目的基因的線性化的質(zhì)粒DNA，也可以是比擴(kuò)增片段長(zhǎng)的純化后的PCR產(chǎn)物，當(dāng)然也可以是基因組D