熒光定量pcr之絕對定量分析——標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

1、熒光定量熒光定量PCR之絕對定量分析之絕對定量分析——標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制1.絕對定量定義絕對定量是用已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線來推算未知樣品的量。將標(biāo)準(zhǔn)品稀釋至不同濃度，作為模板進行PCR反應(yīng)。以標(biāo)準(zhǔn)品拷貝數(shù)的對數(shù)值為橫坐標(biāo)，以測得的CT值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，對未知樣品進行定量時，根據(jù)未知樣品的CT值，即可在標(biāo)準(zhǔn)曲線中得到樣品的拷貝數(shù)。Log(起始濃度)與循環(huán)數(shù)呈線性關(guān)系，通過已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，即得到

2、該擴增反應(yīng)存在的線性關(guān)系由樣品CT值，就可以計算出樣品中所含的模板量2.絕對定量標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)品的一些標(biāo)準(zhǔn)必須用與擴增目的基因相同的引物進行擴增，并且擴增效率相同標(biāo)準(zhǔn)品必須是經(jīng)過準(zhǔn)確定量的（我們通常用的是ASP3700紫外光可見光微量分光光度計）標(biāo)準(zhǔn)品必須是標(biāo)準(zhǔn)化的（例如，同一化的細胞數(shù)）在每組實驗時，必須用相同的閾值設(shè)定來確定CT值標(biāo)準(zhǔn)品可以是含有目的基因的線性化的質(zhì)粒DNA，也可以是比擴增片段長的純化后的PCR產(chǎn)物，當(dāng)然也可以是基因組D