利用Faecalibacterium 16S rDNA基因標記檢測環(huán)境水體中豬糞便污染的研究.pdf

1、隨著養(yǎng)豬產業(yè)的快速發(fā)展，豬糞便污染問題愈發(fā)嚴重，這對生態(tài)環(huán)境和人類健康都造成嚴重威脅。而傳統(tǒng)糞便指示菌大腸桿菌由于在自然環(huán)境中能夠生存且繁殖，因此無法準確追蹤宿主糞便污染源。本研究通過采集126份動物糞便樣品（包含雞，鴨，人，狗，豬，牛），應用高能量測序技術研究了糞便微生物種類及其多樣性，選用微生物源示蹤技術（MST），以 Faecalibacterium菌為糞便污染指示菌，根據其16S rDNA序列設計引物并篩選豬糞便污染物的特異性分

2、子標記，以定量PCR方法對豬糞便污染源進行檢測與追蹤。
　　高通量測序共獲取146,038條細菌16S rDNA序列。其中厚壁菌門在動物糞便中豐度較高，約占39.10％-69.44%；其次為擬桿菌門（10.64%-48.41%）、變形菌門（0.060%-39.75%）。雞、鴨、牛、豬、人糞便微生物中平均Shannon指數分別為1.21、1.22、1.13、0.83與0.94；平均Simpson指數分別為0.65、0.63、0.60

3、、0.46與0.55。對不同物種糞便污染物Faecalibacterium菌16S rDNA基因序列的保守區(qū)和可變區(qū)進行比對，設計一對Faecalibacterium菌通用引物（FUP）以及兩對特異性引物（PFB-1和PFB-2）。PCR結果顯示FUP在所有糞便DNA樣品中均能擴增出目的片段，片段大小為237 bp。PFB-1和PFB-2僅在豬混合糞便樣品中擴增出目的片段，片段大小分別為172 bp和225 bp，兩對引物的特異性均達到

4、100%，與其他物種糞便污染物之間無交叉反應；研究表明PFB-2陽性率（90%）略高于PFB-1（86%），且PFB-2引物的最低檢測限（LOQs）（2.9拷貝數/100 ml）低于PFB-1（6.53拷貝數/100 ml）引物。由此可見 PFB-2比PFB-1的靈敏度更高，更適合用來對水體中豬糞便污染進行追蹤和檢測。此外，使用定量PCR考察了PFB-2在不同溫度和光照處理下的衰變特性，在15 ℃、黑暗條件下，衰變速率為0.0647 h

5、-1，持續(xù)時間為71.17 h；在25 ℃、光照條件下，衰變速率為k1=0.1112 h-1，持續(xù)時間為41.41 h，表明低溫和暗環(huán)境下分子標記的衰變速率較慢。最后，隨機采集實際環(huán)境水樣，驗證 PFB-2作為豬糞便污染標記物的實際效果，在豬農場附近采集的三份水樣中檢測到的濃度分別為8.4±0.7×104、4.5±0.5×103和3.6±1.2×102拷貝數/100 ml。而在其它地點采集的水樣中的檢測結果為陰性。本研究實現(xiàn)對近期豬糞便