16S rDNA PCR-DGGE結(jié)合測(cè)序技術(shù)在新生兒腸道微生態(tài)及敗血癥病原檢測(cè)中的應(yīng)用.pdf

1、第一部分經(jīng)陰道分娩和剖宮產(chǎn)對(duì)新生兒早期腸道菌群構(gòu)成的影響
　　目的：本項(xiàng)研究旨在利用16S rDNA PCR-DGGE結(jié)合測(cè)序技術(shù)闡明經(jīng)陰道分娩和剖宮產(chǎn)兩種生產(chǎn)方式對(duì)新生兒早期腸道菌群多樣性的影響。
　　方法：收集生后2天和4天新生兒的大便樣本（經(jīng)陰道分娩嬰兒25例，剖宮產(chǎn)嬰兒16例）。利用16S rDNA PCR-變性梯度凝膠電泳（DGGE）分析大便樣本的菌群多樣性，利用16S rRNA基因測(cè)序技術(shù)對(duì)DGGE條帶進(jìn)行測(cè)序以

2、明確細(xì)菌種類。
　　結(jié)果：生后2天經(jīng)陰道分娩和剖宮產(chǎn)新生兒腸道菌群的多樣性指數(shù)：Shannon指數(shù)分別為1.94±0.29及2.30±0.25；Simpson指數(shù)分別為0.15±0.05及0.11±0.28；Shannon均勻度指數(shù)分別為0.95±0.25及0.97±0.15。生后4天經(jīng)陰道分娩及剖宮產(chǎn)新生兒的腸道菌群多樣性指數(shù)：Shannon指數(shù)分別為2.32±0.12及2.64±0.14；Simpson指數(shù)分別為0.10±0.

3、01及0.07±0.10；Shannon均勻度指數(shù)分別為0.98±0.08及0.99±0.05。經(jīng)陰道分娩及剖宮產(chǎn)兩組豐富度及均勻度指數(shù)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。經(jīng)陰道分娩及剖宮產(chǎn)兩組在腸道菌群種類構(gòu)成方面具有顯著差異：經(jīng)陰道分娩新生兒大便菌群以大腸桿菌（占92.86％）、擬桿菌屬（占78.57%）和長(zhǎng)雙歧桿菌（占83.33%）為主。剖宮產(chǎn)新生兒大便菌群則以葡萄球菌屬（占72.73%）、梭菌屬（占45.45%）、腸桿菌屬（占45.4

4、5%）和鏈球菌屬（占70.00%）為主。
　　結(jié)論：本研究的結(jié)果表明經(jīng)陰道分娩和剖宮產(chǎn)新生兒腸道菌群的菌群種類有顯著差異，生產(chǎn)方式可影響腸道菌群種類組成。
　　第二部分新生兒晚發(fā)敗血癥多重病原菌檢測(cè)方法探討
　　第一章16S rDNA PCR-DGGE結(jié)合測(cè)序技術(shù)檢測(cè)新生兒晚發(fā)敗血癥多重致病菌可行性的初步探討
　　目的：探討利用16S rDNA PCR-變性梯度凝膠電泳（DGGE）結(jié)合測(cè)序技術(shù)對(duì)新生兒晚發(fā)敗血癥多

5、重病原菌進(jìn)行檢測(cè)的可行性。
　　方法：收集14份診斷為敗血癥患兒的血液樣本及制作24例模擬敗血癥血液樣本（將不同稀釋濃度糞腸球菌的DNA分別添加至固定濃度的銅綠假單胞菌和表皮葡萄球菌 DNA混合液中），利用16S rDNA PCR-DGGE結(jié)合測(cè)序技術(shù)對(duì)血液樣本中的病原菌進(jìn)行檢測(cè)。將檢測(cè)結(jié)果與血培養(yǎng)結(jié)果進(jìn)行比較分析。
　　結(jié)果：14例血培養(yǎng)陽(yáng)性血液樣本中有5份樣本16S rDNA PCR-DGGE結(jié)合測(cè)序技術(shù)所檢測(cè)到的病原菌

6、種類部分或全部與血培養(yǎng)結(jié)果相同。另9份樣本中，血培養(yǎng)未能檢測(cè)到奈瑟菌屬、莫拉克斯菌屬等分子生物學(xué)方法所發(fā)現(xiàn)的細(xì)菌。而16S rDNA PCR-DGGE結(jié)合測(cè)序技術(shù)亦未能將肺炎克雷伯菌和糞腸球菌等血培養(yǎng)證實(shí)的病原菌檢出。對(duì)模擬敗血癥樣本進(jìn)行病原菌種特異性 PCR及16S rDNA PCR-DGGE檢測(cè)發(fā)現(xiàn)僅含糞腸球菌 DNA的樣本糞腸球菌的最低檢測(cè)限為稀釋57倍（8.32×10-4ng/μl），而與銅綠假單胞菌、表皮葡萄球菌混合添加樣本中

7、，糞腸球菌DNA最低檢測(cè)限僅為稀釋52倍（2.60ng/μl）。
　　結(jié)論：16S rDNA PCR-DGGE結(jié)合測(cè)序技術(shù)與傳統(tǒng)血培養(yǎng)方法相比可檢測(cè)到更廣的多重病原菌譜。而其應(yīng)用會(huì)受到16S rDNA PCR擴(kuò)增過程中的競(jìng)爭(zhēng)性抑制現(xiàn)象的影響。在實(shí)際應(yīng)用時(shí)需注意這種競(jìng)爭(zhēng)性抑制現(xiàn)象可能導(dǎo)致的假陰性結(jié)果。
　　第二章16S rDNA PCR-DGGE在檢測(cè)敗血癥血標(biāo)本時(shí)外源性細(xì)菌DNA污染問題的初步探討
　　目的：對(duì)16S

8、rDNA PCR-DGGE檢測(cè)敗血癥血標(biāo)本時(shí)的外源性細(xì)菌基因組DNA污染問題進(jìn)行初步研究與探討。
　　方法：收集晚發(fā)敗血癥和新生兒黃疸（非感染引起）新生兒的血液樣本各14例和10例。分別以未使用溶菌酶溶液與使用溶菌酶溶液（對(duì)照組）對(duì)上述血液樣本進(jìn)行細(xì)菌 DNA的提取，再行16S rDNA PCR-DGGE檢測(cè)，比較兩種DNA提取方法所得出的DGGE圖譜之間的差異。
　　結(jié)果：不同血液樣本使用溶菌酶進(jìn)行血液細(xì)菌DNA提取后經(jīng)1

9、6S rDNA PCR-DGGE檢測(cè)所得到的DGGE圖譜完全一致，表現(xiàn)為電泳位置完全相同的條帶圖譜，測(cè)序后顯示為弧菌屬、大腸桿菌及氣單胞菌屬。未使用溶菌酶進(jìn)行血液細(xì)菌DNA提取，新生兒敗血癥血標(biāo)本中檢測(cè)出包含有表皮葡萄球菌、棒狀桿菌屬、鹽單胞菌屬以及丙酸菌屬等細(xì)菌。陰性對(duì)照組（新生兒黃疸血液）和空白對(duì)照組（ddH2O）樣本則分別檢出數(shù)量和電泳位置明顯不同的14個(gè)條帶和17個(gè)條帶。
　　結(jié)論：血液內(nèi)細(xì)菌DNA提取過程中溶菌酶溶液所含