牦牛消化道乳酸菌的分離鑒定及其16S rDNA-SSCP分析.pdf

1、本研究以采自7個(gè)不同地區(qū)的牦牛糞便、腸道內(nèi)容物為材料(樣品共93個(gè))用厭氧培養(yǎng)法進(jìn)行乳酸菌的分離、純化得到乳酸菌71株。通過(guò)生化實(shí)驗(yàn)和6種不同溫度、5種不同pH、2種不同NaCl(％)下的生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)鑒定后得到短乳桿菌5株，嗜糞乳桿菌3株，腸乳桿菌8株，嗜酸乳桿菌8株，保加利亞乳桿菌3株，彎曲乳桿菌2株，發(fā)酵乳桿菌11株，干酪乳桿菌4株，乳酸乳桿菌6株，植物乳桿菌9株，嗜熱鏈球菌3株，乳酸乳球菌2株，糞腸球菌3株，尿腸球菌2株，海氏腸球菌2

2、株。共71株15種乳酸菌。其中乳酸桿菌59株，球菌12株。 從這15種菌中各取2株，培養(yǎng)36h后制成菌體懸液，用1mol/L的鹽酸調(diào)節(jié)乳酸菌的菌懸液的pH值，分別為2.0，3.0，4.0并于37℃處理5h。取菌懸液，在平皿上菌落計(jì)數(shù)。結(jié)果表明：Q1、Q6、Q3、Q4、Q7、Q8、ZH1、70、69、59、23、54、N3、N4、10、Z5、1、3、19有較強(qiáng)的耐酸性。在pH為2存活率仍然大于10％；在pH為3存活率在40％左右；

3、在pH為4時(shí)存活率都大于85％。將供試菌株接種于膽酸鹽濃度分別為0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％的蛋白胨水培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)36h，用分光光度計(jì)測(cè)定OD660值結(jié)果發(fā)現(xiàn)Q1、Q6、Q3、Q4、Q9、Q10、ZH1、70、69、59、N1、N5、N3、N4、10、Z5、1、3、19都可耐受0.60％的膽酸鹽。用單層瓊脂平板擴(kuò)散法對(duì)乳酸菌培養(yǎng)液抑菌功能、乳酸菌代謝產(chǎn)物抑菌功能、乳酸菌代謝產(chǎn)物溫度處理下的抑菌功能、

4、乳酸菌代謝產(chǎn)物的酸堿處理后的抑菌功能、代謝產(chǎn)物的酶處理后的抑菌功能進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果表明：這些菌的培養(yǎng)液、代謝產(chǎn)物、代謝產(chǎn)物高溫處理后、代謝產(chǎn)物的酸堿處理后、代謝產(chǎn)物的酶處理后、都具有一定的抑菌效果，抑菌圈在13mm-30mm之間，多數(shù)在20mm-27mm。 參考GenBank中的各種乳酸菌16SrDNA基因序列，并經(jīng)過(guò)多次比較，用Premier軟件設(shè)計(jì)1對(duì)擴(kuò)增乳酸菌16SrDNA從371-838的上下游引物，對(duì)Q1、Q3、Q7、Q

5、9、ZH1、59、23、N3、19、1，這10種菌16SrDNA的這段可變區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增，均得到約470bp左右的產(chǎn)物。SSCP電泳發(fā)現(xiàn)這10種菌的這段可變區(qū)序列呈現(xiàn)10種不同的條帶。 對(duì)實(shí)驗(yàn)效果較好的5種菌的16SrDNA這段可變區(qū)進(jìn)行序列測(cè)定。測(cè)序結(jié)果經(jīng)DNAStar分析表明這5株菌的同源性在87.3％-95.6％之間。且這5株菌與GeneBank各自的標(biāo)準(zhǔn)序列的同源性分別為：Q1為98.51％；Q7為98.94％；ZH1為98