出凝血檢查

1、實(shí)驗(yàn) 出凝血檢查,上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院余文紅,（一）血標(biāo)本的采取應(yīng)注意的問(wèn)題,,,1. PT、APTT凝血實(shí)驗(yàn)檢查均使用靜脈血。采血人員應(yīng)技術(shù)熟練，以防止組織損傷，外源性凝血因子進(jìn)入針管。,,2．一般血液采集，進(jìn)入容器至進(jìn)行實(shí)驗(yàn)所用的時(shí)間越短，所分析的凝血因子被保護(hù)得越好。從輸液三通管取出血的做法不可取。,,3．取血時(shí)病人應(yīng)松馳，環(huán)境溫暖，防止靜脈攣縮，止血帶的壓力要盡可能小，取血時(shí)，拉針?biāo)ǖ乃俣纫鶆?，使血液平穩(wěn)地進(jìn)入注射器

2、，防止氣泡的產(chǎn)生。,,4．一旦取樣完畢，立即與抗凝劑充分混合，一般提倡使用真空采血管。,,5．用硅化玻璃或塑料注射器采血。考慮結(jié)果的精確性，應(yīng)將試管刻度的可能誤差控制在既定體積的10%以內(nèi)。,,6.采血后標(biāo)本在低溫保存且在一定時(shí)間范圍內(nèi)。,,7. 國(guó)際血液學(xué)標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)（ICSH）、國(guó)際血栓與止血委員會(huì)（ICTH）推薦使用3.2g/dl（含2H2O）或0.109mol/L的枸櫞酸鈉作為凝血因子檢查的抗凝劑。,,8.抗凝劑在血標(biāo)本的絕對(duì)含

3、量可改變血漿中鈣離子濃度，進(jìn)而影響試驗(yàn)結(jié)果，因此應(yīng)根據(jù)患者紅細(xì)胞比例（Hct）狀況隨時(shí)調(diào)整抗凝劑用量。,（二）應(yīng)用試劑應(yīng)注意的問(wèn)題,,,1.組織凝血活酶工作制劑的國(guó)際敏感指數(shù)（ISI），為了使不同敏感性的組織凝血活酶在檢測(cè)PT中能得到同樣的結(jié)果，必須要制定一個(gè)共同的敏感性指標(biāo)。,,2.凝血活酶和部分活化凝血活酶的使用步驟必須嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。通常在使用前必須充分混勻試劑，以使微粒重新均勻懸浮于液體中。,,3.試劑準(zhǔn)備過(guò)程中應(yīng)該使用去

4、離子水。,,4.正常對(duì)照血漿通常將多份健康人血標(biāo)本混在一起，以彌補(bǔ)個(gè)體誤差。,（三）使用實(shí)驗(yàn)器材應(yīng)注意的問(wèn)題,,,1. 玻璃器皿的要求：貯存和測(cè)試時(shí)應(yīng)選用干凈、沒(méi)有劃痕的試管。,,2. 溫度的要求：人工測(cè)定終點(diǎn)法要求水浴箱的溫度必須保持在（37±1）℃，并且周?chē)彰髟O(shè)備要好，便于讀取終點(diǎn)。,（四）實(shí)驗(yàn)操作應(yīng)注意的問(wèn)題,,,1. 許多試驗(yàn)誤差都來(lái)源于技術(shù)的錯(cuò)誤。在實(shí)驗(yàn)技術(shù)、試劑、溫度及pH值上很微小的變化都會(huì)導(dǎo)致試驗(yàn)結(jié)果明顯的變

5、化。,,2. 手工法PT或試管法CT檢查時(shí)，傾斜試管動(dòng)作一定要輕，角度要小，以減少血液與管壁的接觸面積。,,3. 血液凝固主要是酶催化的反應(yīng)，所以實(shí)驗(yàn)過(guò)程中要嚴(yán)格控制理想的pH環(huán)境和溶液的離子強(qiáng)度。,,4. 試驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確還取決于所用的反應(yīng)物的量、加入順序和不同反應(yīng)物的孵育時(shí)間。,,5. APTT、PT需乏血小板血漿。,,6. 試驗(yàn)前檢查血漿是否有溶血、黃疸、脂血和出現(xiàn)凝塊。,7. 報(bào)告方式：以PT的秒（s）數(shù)報(bào)告。以患者PT（s）/

6、正常對(duì)照（s）的比（PTR）報(bào)告。在口服藥物治療監(jiān)控時(shí)以INR報(bào)告。ICSH規(guī)定，不再用百分比（活動(dòng)度）報(bào)告。APTT以秒報(bào)告。,1987年WHO提出PT值用INR（international normalized ratio國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化比值）作為PT結(jié)果報(bào)告形式，并用以作為抗凝治療監(jiān)護(hù)的指標(biāo)。,,,INR=［病人PT（s）/正常人平均PT（s）］ISIPTR=受檢者PT（s）/正常對(duì)照PT（s）INR=PTRISIISI：國(guó)

7、際敏感指數(shù)（international sensitivity index）1～1.9,,CT、PT、APTT、RT、Fg、TT,凝 血 時(shí) 間 測(cè) 定,C T,目的：掌握玻璃試管法凝血時(shí)間測(cè)定的方法,,原理：,離體靜脈血與玻璃表面接觸后，血中XII因子活化并啟動(dòng)內(nèi)源性凝血途徑，最終生成纖維蛋白而使血液凝固所需的時(shí)間。,器材：,6mm直徑玻璃試管3支靜脈采血器材37℃恒溫浴箱秒表,,步驟：3支試管各1ml血，每隔0.5min傾斜

8、，第一管計(jì)時(shí)后，立即觀察第二、三管并計(jì)時(shí)，直至血液凝固。結(jié)果判斷：從血液剛進(jìn)入注射器至第3管凝固所需時(shí)間即為凝血時(shí)間。,,正常參考值：4～12分鐘報(bào)告方式：CT X.Xmin（玻璃試管法）,注意事項(xiàng)：,試管應(yīng)潔凈干燥，抽血應(yīng)“一針見(jiàn)血”且血液中不含泡沫。溫度恒定為37℃，傾斜試管角度應(yīng)在30°左右。,評(píng)價(jià)：,凝血時(shí)間曾用玻片法測(cè)定，但由于毛細(xì)血管采血，易混入組織液而使凝血時(shí)間正常，屬于淘汰方法。延長(zhǎng)：嚴(yán)重內(nèi)源性凝血

9、途徑凝血因子有缺陷；血中抗凝物質(zhì)增多；肝素治療縮短：高凝狀態(tài)（DIC早期）,凝 血 酶 原 時(shí) 間 P T,,原理：,在乏血小板血漿中加入組織因子和鈣離子（鈣凝血活酶）后，血漿發(fā)生凝固的時(shí)間即為凝血酶原時(shí)間（PT）。,步驟：,取空腹靜脈血1.8ml加入含有0.2ml109mmol/L枸櫞酸鈉的試管中混勻備用?？鼓?000r/min離心10min分離血漿將試劑、正常人混合血漿、待測(cè)血漿與37℃預(yù)熱5min。血漿0.1ml加入

10、混勻的試劑0.2ml，開(kāi)動(dòng)秒表計(jì)時(shí)。,,正常參考值：PT：11～13秒PTR：1±0.15INR：0.8～1.5,,報(bào)告方式：PT：X.Xs，正常人血漿X.XsPTR：X.XINR：X.X,注意事項(xiàng)：,試管應(yīng)潔凈干燥，抽血應(yīng)“一針見(jiàn)血”，抗凝劑與血液比例（1：9）應(yīng)準(zhǔn)確。取血后4h內(nèi)完成測(cè)定。鈣凝血活酶必須標(biāo)有國(guó)際敏感指數(shù)（ISI），ISI越接近于1.0越敏感。標(biāo)本測(cè)定前應(yīng)先測(cè)定正常人混合血漿，其PT值在允許范

11、圍內(nèi)才能測(cè)定樣本。,評(píng)價(jià)：,血漿凝血酶原是一種篩選試驗(yàn)，是用來(lái)證實(shí)先天性或獲得性纖維蛋白原、凝血酶原和凝血因子V、VII、X的缺陷或相應(yīng)抑制物的存在，也用于監(jiān)測(cè)口服抗凝治療時(shí)引起的凝血酶原和因子VII、X水平的下降。,實(shí)質(zhì)：,對(duì)檢測(cè)樣本（血漿）中存在凝血激酶時(shí)的再鈣化反應(yīng)，這種過(guò)程包括了因子VIIa、組織因子、磷脂、鈣離子對(duì)凝血酶原的活化，凝血酶裂解纖維蛋白原和纖維蛋白單體的聚集交聯(lián)。,活化部分凝血活酶時(shí)間測(cè)定APTT,,原理：,用白

12、陶土激活XII因子、腦磷脂代替血小板磷脂，測(cè)定乏血小板血漿加入Ca2++后凝固所需時(shí)間。,步驟：,采血 空腹靜脈血1.8ml+0.2ml 109mmol/L枸櫞酸鈉混勻。分離血漿 3000r/min離心10分鐘分離血漿。溶解試劑 臨用時(shí)加1ml蒸餾水，室溫靜置15min以上，混勻后使用。預(yù)溫活化 0.1ml血漿+APTT試劑0.1ml混勻，37℃準(zhǔn)確孵育3min（其間輕輕搖動(dòng)數(shù)次）加鈣計(jì)時(shí) 加入0.1ml 25mmol/L C

13、aCl2混勻并立即開(kāi)動(dòng)秒表計(jì)時(shí)，20s后，觀察混合液流動(dòng)狀態(tài)。,,正常參考值：一般在33.68～40.32s（不同儀器和試劑所測(cè)之參考值有差別）報(bào)告方式： APTT：XX.Xs，正常人血漿：XX.Xs,注意事項(xiàng)：,采血時(shí)穿刺盡量一針見(jiàn)血，不要淤血和氣泡，采血后立即與抗凝劑混合，盡快送往實(shí)驗(yàn)室。使用枸櫞酸鹽（抗凝）血漿 如果不能立即測(cè)試，應(yīng)盡快分離血漿，盛血漿的容器加塞，防止PH值改變血漿在2～8℃下保留7天 鈣凝血活酶必須

14、標(biāo)有國(guó)際敏感指數(shù)（ISI），ISI越接近于1.0越敏感。,臨床意義：,APTT延長(zhǎng)：表明有內(nèi)源性凝血途徑有關(guān)因子的缺陷（血友病）和纖維蛋白原缺乏。 纖維活力增加，如繼發(fā)性，原發(fā)性纖溶以及血循環(huán)中有纖維蛋白（原）降解產(chǎn)物（FDP）。 血循環(huán)中有抗凝物質(zhì)。,,APTT縮短：　　　 高凝狀態(tài)，如DIC的高凝期，促凝物質(zhì)進(jìn)入血液以及凝血因子的活性增高等。,評(píng)價(jià)：,APTT和PT同時(shí)檢測(cè)是目前二期止血缺陷的主要篩選試驗(yàn)組合。,在有臨床出血

15、癥狀的前提下：,APTT PT 提示正常 延長(zhǎng) 因子VII的缺陷延長(zhǎng) 正常 因子VIII、IX、XI缺陷正常 正常 懷疑因子X(jué)III缺陷可能延長(zhǎng) 延長(zhǎng) 除因子II、V、I、X缺陷 外，主要是異?？鼓镔|(zhì) 的增多,,,,,血漿復(fù)鈣時(shí)間RT,,原理：,在去鈣離子的抗凝血漿中，重新加入適量的鈣后，血漿發(fā)生凝固。,步驟：,0.2ml 0.1mol

16、/L草酸鈉+靜脈血1.8ml混勻，離心分離血漿。0.1ml血漿置37℃水浴中，+0.025mol/L CaCl2 0.1ml，立即開(kāi)動(dòng)秒表記錄時(shí)間。,,正常參考值： 2.08±0.49分（2.18~3.77分鐘）,注意事項(xiàng)：,不要溶血，否則時(shí)間縮短CaCl2新鮮配制分離血漿以1000轉(zhuǎn)/分為宜，高速離心可使大量血小板下沉而導(dǎo)致復(fù)鈣時(shí)間延長(zhǎng)。,復(fù)鈣交叉時(shí)間RT,,步驟：,按下列比例準(zhǔn)備5份待測(cè)血漿：加樣量

17、 1 2 3 4 5受檢血漿（ml）－ 0.01 0.05 0.09 0.10正常血漿（ml）0.10 0.09 0.05 0.01 －上述試管，置37℃ 1min，加0.025mol/LCaCl2 0.1ml，混勻后，記錄血漿凝固時(shí)間。,,,,注意事項(xiàng)：,所用血漿均為富含血小板血漿，分離出血漿后需在2h內(nèi)檢測(cè)完畢。,臨床意義：,RT最早作為內(nèi)源性凝血系統(tǒng)相關(guān)凝血因子缺陷的篩

18、選檢查，但由于這個(gè)試驗(yàn)不如APTT，又容易受血小板數(shù)量和功能影響，目前只用來(lái)篩選是否存在病理性抗凝物質(zhì)增多。,,延長(zhǎng)的復(fù)鈣時(shí)間如被1/10量的正常血漿所糾正，則表示受檢血漿中缺乏內(nèi)源凝血因子；如不被少量正常血漿糾正，提示存在異?？鼓镔|(zhì)。,血漿纖維蛋白原Fg,,,纖維蛋白原的測(cè)定方法眾多，大體上分三大類：基于經(jīng)加凝血酶后，形成纖維蛋白的方法，即可凝固蛋白法。物理、化學(xué)測(cè)定法。免疫學(xué)測(cè)定法。,目的和原理,,,為了解凝血途徑最后環(huán)節(jié)

19、的狀況，排除纖維蛋白原減少、異常對(duì)凝血篩選試驗(yàn)的影響，了解纖溶活動(dòng)度等可選擇本試驗(yàn)。,,Clauss法以凝血酶作用于受檢血漿中的纖維蛋白原，使其形成纖維蛋白，血液凝固。,,纖維蛋白原的量與凝固時(shí)間成負(fù)相關(guān)，檢測(cè)結(jié)果與參比血漿制成的標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)比可得出纖維蛋白原的含量。,步驟：,將參比血漿用血漿稀釋液作原倍、1：2、1：4、1：8、1：16稀釋5管。取稀釋血漿0.2ml于小試管中，置37℃水浴預(yù)熱2分鐘，再加凝血酶溶液0.1m

20、l，記錄時(shí)間。,,,,,,,,,,相關(guān)分析：,首先先清除內(nèi)存。INV+AC，濃度（log或In）XD，YD輸入（如不取對(duì)數(shù)，濃度直接輸入XD，YD 讀取值DATA輸入；全部數(shù)據(jù)輸入完畢，按INV+9讀出相關(guān)系數(shù)r。待測(cè)讀數(shù)INV+log或In→讀出相關(guān)濃度。如不取對(duì)數(shù)，待測(cè)讀數(shù)直接INV+?x→讀出相關(guān)濃度。最終濃度需根據(jù)樣品稀釋倍數(shù)乘積。,^,標(biāo)準(zhǔn)曲線：,t（s）2520151050 0.5

21、 1 1.5 2 2.5C（g/L）,,,,,,,,,,,,,,,如血漿纖維蛋白原含量大于4 g/L時(shí)，應(yīng)稀釋血漿后重測(cè)，結(jié)果乘以稀釋倍數(shù)。低于0.8 g/L時(shí)，需將原血漿改為1∶2或1∶5稀釋，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得結(jié)果后，除以5或除以2。,,正常參考值： 2～4mg/ml,臨床意義：,纖維蛋白原增高除生理情況下的應(yīng)激反應(yīng)、妊娠后期外，主要出現(xiàn)感染、灼傷、動(dòng)脈粥樣硬化、急性心肌梗死、

22、多發(fā)性骨髓瘤、糖尿病、敗血癥等。纖維蛋白原減少見(jiàn)于DIC、原發(fā)性纖溶亢進(jìn)癥、重癥肝炎、肝硬化和溶栓治療時(shí)。,評(píng)價(jià)：,Clauss方法測(cè)定的是纖維蛋白原功能，因此需纖維蛋白原結(jié)構(gòu)正常，且有一定的含量，對(duì)低（無(wú)）纖維蛋白原血癥和因此后纖維蛋白原血癥應(yīng)改用ELISA和RIA等免疫檢測(cè)手段。,主要誤差來(lái)源：,血漿稀釋不準(zhǔn)。凝血酶活性不足或失效。凝血酶一般應(yīng)在低溫保存，稀釋后在塑料(聚乙烯)試管中，置4℃可保存活性24小時(shí)。測(cè)定終點(diǎn)觀察不準(zhǔn)

23、確，尤其是纖維蛋白原含量高時(shí)，往往很快即凝固，手工法重復(fù)性較差，不易做準(zhǔn)。,血漿凝血酶時(shí)間TT,,原理,以標(biāo)準(zhǔn)凝血酶溶液加入受檢血漿，使凝血酶裂解血漿中的纖維蛋白原，形成纖維蛋白，造成血漿凝固，此時(shí)所需時(shí)間為凝血酶時(shí)間。,方法：,0.1ml血漿+0.1mlTT試劑，37℃水浴中觀察凝固時(shí)間。,正常參考值：,16~18S,評(píng)價(jià)：,時(shí)間大于正常參考值3秒：DIC、肝臟病變。,,TT時(shí)間縮短，并不代表高凝狀態(tài)或DIC前期，是技術(shù)原因。如操作失