科室講座

1、流式細胞術在白血病中的臨床應用,新疆自治區(qū)人民醫(yī)院檢驗科莫紅梅,一、簡介流式細胞術二、簡介白血病三、流式細胞術在白血病中的應用(結合病例分析),一、簡介流式細胞術,1.流式細胞術（flow cytometry,FCM）：以流式細胞儀測量懸浮細胞的一種現(xiàn)代細胞分析技術。綜合運用電子、激光、計算機和流體力學等與熒光標記、分子免疫學、分子遺傳學及分子生物學等結合，對細胞的生理功能和特性進行分析。,散射光信號,Right A

2、ngle Light Detector ? Cell ComplexitySSC,Forward Light Detector ? Cell Surface Area FSC,Incident Light Source,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,前向角散射光（FSC, Forward Scatter）細胞相對大小及其表面積 側(cè)向角散射光（SSC,

3、 Side Scatter）細胞粒度及細胞內(nèi)相對復雜性,Laser,FALS Sensor,流式細胞儀的檢測信號,熒光信號使用熒光標記的單克隆抗體染色，做多色分析熒光信號的強弱，反映了細胞抗原的表達含量,熒光信號,雙色直接染色,外周全血細胞散射光雙參數(shù)點圖（紅細胞溶解后）,二、簡介白血病,造血干細胞分化過程的不同階段發(fā)生分化阻滯、凋亡障礙和惡性增殖而引起的一組異質(zhì)性的造血系統(tǒng)惡性腫瘤。,1.白血病：常見的惡性腫瘤之一,根據(jù)白

4、血病細胞的成熟程度和自然病程：,急性：原始細胞、早期幼稚細胞為主，自然病程僅數(shù)月慢性：較成熟幼稚細胞和成熟細胞為主，自然病程常為數(shù)年,淋系、髓系（單核和粒細胞）急淋、急非淋（急性髓系白血病）慢淋、慢粒,根據(jù)主要受累的細胞系可分：,2、白血病的病因,放射因素化學因素病毒因素遺傳因素其它血液?。郝?、真性紅細胞增多癥、原發(fā)性血小板增多癥、骨髓纖維化、MDS、PNH、淋巴瘤、MM,3、發(fā)病率,占癌癥發(fā)病率的5%，我

5、國發(fā)病率2-4/10萬，美國9.6/10萬，歐洲4.3-9.0/10萬。,我國白血病的流行現(xiàn)狀及特點,急性：慢性5.5：1急性髓系白血病最多，其次急淋、慢粒，慢淋少成人急白以急粒為多見兒童以急淋為多見慢粒白血病隨年齡增長發(fā)病率逐漸升高慢淋在50歲以后才明顯增多男性略高于女性1.18：1,現(xiàn)有的分型：,FAB1976年形態(tài)分類1985-1986MIC:MorphologyImmunolog

6、y Cytogenetics WHO1995-1997細胞遺傳學NCI1990,FAB1991年修訂：急性髓系白血病,M0 急性髓系白血病微分化型M1急性粒細胞白血病未分化型M2急性粒細胞白血病部分分化型M3急性早幼粒細胞白血病M4急性粒單核細胞白血病M5急性單核細胞白血病M6紅白血病M7急性巨核白血病,急性淋巴細胞白血病,B細胞系T細胞系,4、臨床特點,起?。喊l(fā)病急驟或緩慢起病急者

7、往往可沒有前驅(qū)癥狀，突然發(fā)病，以發(fā)熱、多部位出血、進行性蒼白或骨、關節(jié)疼痛等為首發(fā)癥狀。起病緩慢者以蒼白、乏力、虛弱和食欲減退等癥狀開始，可進行性加重，以后多有發(fā)熱、出血等。,發(fā)熱是最常見癥狀。感染原因：中性粒細胞減少或缺乏；中性粒細胞功能異常；免疫功能尤其是細胞免疫功能低下，或化療、糖皮質(zhì)激素的應用；白血病細胞在全身各臟器廣泛浸潤，尤其是高白細胞浸潤后使組織缺氧，局部組織出血、壞死，增加了細菌滋生機會。抗生素的使用不

8、正確，尤其是條件致病菌及真菌的感染,發(fā)熱和感染,急白：幾乎所有患者都有不同程度出血，其中以M3和M5出血重。慢性白血病:不常見原因：血小板質(zhì)和量異常DIC :M3易發(fā)生凝血因子缺乏,出血,原因：骨髓中紅細胞系的造血被白血病細胞增殖所替代或受到白血病細胞分泌的抑制因子所抑制，使骨髓中紅細胞的生成減少，并使幼稚紅細胞對紅細胞生成素的反應減弱。無效紅細胞生成；幼稚紅細胞增生異常。溶血：多見于ALL、CLL,急白合并DIC時常有

9、微血管病性溶血。其它：急慢性失血及某些抗代謝化療藥物,貧血,白血病細胞大量繁殖，使骨髓內(nèi)張力增高而發(fā)生疼痛；白血病細胞也可浸潤骨皮質(zhì)和骨膜，發(fā)生局部腫塊，還可以引起骨皮質(zhì)破壞缺損引起疼痛；白細胞壞死引起高尿酸血癥致痛風、融骨性粒細胞肉瘤等，均可引起骨痛。肢體劇烈疼痛多見于ALL,兒童白血病多浸潤關節(jié)，成人主要疼痛部位在胸骨、肋骨及脊椎等。,骨、關節(jié)疼痛,神經(jīng)系統(tǒng)白血病細胞?？汕旨爸袠猩窠?jīng)系統(tǒng)，以蛛網(wǎng)膜及硬腦膜的浸潤常見。,

10、消化系統(tǒng)消化道的出血常見,肝、脾、淋巴結腫大急白的淋巴結腫大多為表淺的輕度腫大，質(zhì)地較軟，多局限在頜下、頸部、腹部及腹股溝等處。絕大多數(shù)T-ALL有縱膈淋巴結的腫大，但較少引起氣管、頸靜脈壓迫等癥狀。巨脾主要見于CML晚期及其急變、幼淋巴細胞白血病。,呼吸系統(tǒng)肺部浸潤以AML多見，侵犯胸膜發(fā)生胸腔積液以ALL多見，亦可見于AML-M5,多為血性，可見較多白血病細胞。,泌尿系統(tǒng),心臟五官及口腔白血病細胞浸潤口

11、腔黏膜可引起牙齦腫脹增生、巨舌、牙齦出血及口腔潰瘍，以AML-M4和M5最常見；眼眶與球后為綠色瘤的好發(fā)部位。乳腺 綠色瘤 常見于兒童和青年AML患者，尤以M2b多見，少數(shù)以綠色瘤為首發(fā)。綠色瘤浸潤之處皆呈綠色，是由于含大量的過氧化物酶所致。,電解質(zhì)紊亂低鉀血癥是AML于ALL常見的并發(fā)癥，于溶菌酶增高有關，血及尿中溶菌酶增高損傷腎小管，使近曲小管功能不全，鉀離子排出增多。低鈉血癥高鉀血癥低鈣血癥

12、高磷血癥,3.流式細胞免疫分型的發(fā)展史,1968年——第一臺流式細胞儀 美國斯坦福大學80年代中期——MIC分型我國：1988年——北京大學人民醫(yī)院購入1990年——白血病免疫分型臨床應用,二、FCM在白血病診斷、治療中的應用,白血病分型是白血病的診斷、選擇化療方案、判斷預后的重要依據(jù),外周全血細胞散射光雙參數(shù)點圖（紅細胞溶解后）,1.CD45的臨床應用,CD45是白細胞的共同抗原成分。其分子量介于180—22

13、0Kda之間，屬于T200家族。所有人類白細胞均表達CD45，包括淋巴細胞、單核細胞、多形核細胞、嗜酸、嗜堿性細胞、胸腺細胞、脾細胞、扁桃腺細胞以及骨髓前體細胞。,造血系統(tǒng)細胞CD45表達量與細胞分化程度的高低緊密相關,即：分化程度高的細胞CD45表達量高，分化程度低的細胞CD45表達量低（淋巴細胞>單核細胞>成熟粒細胞>原幼細胞，在紅細胞中不表達；SSC是側(cè)向角參數(shù)，反應細胞的顆粒度（成熟粒細胞>單核細胞>

14、;原幼細胞>淋巴細胞）。目前，國際上采用CD45—SSC設門（Gating），可非常輕松地將白血病細胞與正常細胞分開，增加白血病免疫分型的準確性,正常人骨髓有核細胞免疫表型散點圖,2.FCM在白血病中的應用優(yōu)勢,▲能正確區(qū)別AML和ALL，并能進一步區(qū)別ALL中的T系和B系及亞型▲能正確鑒別AML中難于鑒別的M0、M6、M7▲診斷雙系或雙表型白血病▲發(fā)現(xiàn)僅表達個別次要非本系列相關抗原的白血病▲診斷少見疑難白血病（如HCL）

15、,正常BM各系細胞比率,淋巴20-25%: T: 70%, B: 20%, NK:10%;單核2-6%粒細胞:40-60%有核紅:20-25%,急性B淋巴細胞白血?。˙-ALL）R2：95.15%，CD33,HLA-DR,CD19,CD22,CD10 陽性,,正常B細胞標志,泛B標志：CD19,HLA-DR,cCD79a/CD22幼稚B標志：CD34,TdT,CD10成熟B標志：CD23,FMC7,B-ALL的分

16、型,2個月后復查:R3:73.94%CD33,HLA-DR,CD19, CD22,CD10,CD34陽性,R2：15.14%CD33,HLA-DR,CD19,CD10,CD34,CD22陽性，部分細胞表達CD20,,急性T淋巴細胞白血病（T-ALL）骨髓細胞免疫分型散點圖,,正常T細胞標志：根據(jù)在胸腺內(nèi)發(fā)育階段分類,T-ALL的分型,預后,B-ALL及急性早期B前體細胞白血病的預后差，C-ALL的預后較好。T細胞系ALL的預后一般

17、講，小兒T細胞系ALL預后較差，而成人此型的預后較好。染色體分析對ALL尤其是兒童ALL有重要的預后價值?；旌闲虲LL預后及治療效果比CLL差。,正常單核細胞標志,全單核細胞標志：CD33,CD13,HLA-DR幼稚單核細胞標志：CD34,CD117成熟單核細胞標志：CD14,CD64,正常人骨髓有核細胞免疫表型散點圖,正常粒細胞標志,成熟粒、單核細胞主要區(qū)別,成熟粒細胞：CD33+ HLA-DR- CD14- CD64+di

18、m成熟單核細胞：CD33++ HLA-DR+ CD14+ CD64++,R2:48.18%CD33,HLA-DR,CD34,CD15,CD14,CD64,CD11b,CD13陽性，部分細胞表達CD117,,R3:44.36%CD33,HLA-DR,CD34,CD15,CD117,CD38,CD13陽性,,病例一,某男，49歲，漢，以“咳嗽、咳痰、氣短40天”為主訴入院。血常規(guī)：WBC:33.5×109/L, HB

19、 62g/L,RBC 1.87×1012/L PLT:51×109/L, N 4.3%, L 90% M 5.4%,骨髓白血病免疫分型結果：,R1:98.80%陽性表達：CD33:87.36%, CD13:46.67%, CD38:22.68% CD34:92.49% , HLA-DR:83.99%,, CD19:98.08%, CD10:58.70% , CD20:34.09%, CD22:54.92%,

20、,骨髓形態(tài)：有核細胞增生活躍，粒系增生受抑制，紅系增生活躍，淋巴細胞增生明顯活躍，占81%，其中原始及幼稚淋巴細胞分別占10%和58%。,治療一個療程(長春地辛+去甲氧柔紅霉素+地塞米松)后復查骨髓免疫分型,R2:83.14%陽性表達：CD33:99.53%, CD13:56.26%, CD38:24.47% CD34:98.44% , HLA-DR:99.68%,, CD19:99.39%, CD10:99.42% , CD2

21、0:54.47%, CD22:84.24%,,第二個療程加用阿糖胞苷，2個月后復查骨髓免疫分型（急性白血病雙表型）,,,,,病例二,某男，21歲，哈族，以“間斷發(fā)熱，伴頭暈、乏力一個月”為主訴入院。查體：重度貧血貌，右側(cè)腹股溝處觸及2個0.5*1cm大小淋巴結，邊清，活動可，質(zhì)中，無壓痛，余（-）T：39.6℃，WBC: 1.3×109/L, HB 73g/L, PLT:94×109/L,,骨髓免疫分型,形態(tài)

22、：有核細胞增生極度活躍，粒系增生極度活躍，占96%，以異常早幼粒細胞增生為主。診斷：M3a,6個月后復查：,,急性早幼粒細胞白血?。ˋML-M3）骨髓細胞免疫分型散點圖,某男，73歲，漢，以“發(fā)現(xiàn)雙側(cè)頸部淋巴結腫大1周”為主訴入院。血常規(guī)：WBC:6.49×109/L, HB 80g/L, PLT:214×109/L, N 57.1%, L 33.4% M 7.9% , IgM 32.3g/L,病例三,骨髓白血

23、病免疫分型結果：,R1：61.41%陽性表達：CD19, CD22,HLA-DR, CD20, CD38,FMC-7, CD23, CD5,病理結果：B小淋巴細胞淋巴瘤注意與其它慢性B淋巴細胞增殖性疾病的鑒別,病例四：多毛細胞白血病,典型為外周血全血細胞減少，脾大。血涂片中細胞具有明顯的特征：為中等大小的淋巴細胞，核/質(zhì)比中等。胞質(zhì)亮藍，邊緣不清，具有細且不規(guī)則的“毛”狀胞質(zhì)突起。,,R2:14.60%CD19,CD103,C

24、D20,CD22,HLA-DR,FMC-7,CD23,CD25陽性,診斷白血病主要標志：,B-ALL: CD34, HLA-DR, CD19, CD10+/-, cCD79aT-ALL: CD34, CD38, CD7, CD2+/-, CD5+/-, cCD3AML: CD34, CD117, CD33, CD13, cMPO M2: CD19+: t(8, 21) M3: CD34-, HLA-DR- M4/

25、M5: CD14+ M6: GlyA+, CD71+ M7: IIb/IIIa(CD41, CD61)+,免疫分型對下列情況具有重要意義,用形態(tài)學、細胞化學染色不能肯定細胞來源的白血病。形態(tài)學為急性淋巴細胞白血?。ˋLL）或急性未分化白血?。ˋUL）但缺乏特異性淋巴細胞系列抗原標記。混合性白血病。部分髓系白血病。目前，免疫分型對粒-單核細胞和單核細胞白血病的鑒別尚有一定困難。慢性淋巴細胞白血病。微小殘留白血病。,原始細

26、胞≥90%，胞漿大多透亮或中度嗜堿，無嗜天青顆粒及Auer小體，核仁明顯，類似All-L2型；細胞化學過氧化物酶及蘇丹黑B染色<3%；CD33或/及CD13陽性。淋系抗原陰性，但可有CD7+、TdT+；電鏡過氧化物酶陽性。,M0,原粒細胞（Ⅰ+Ⅱ 型） ≥90%(NEC), 早幼粒細胞很少，中幼粒細胞以下階段不見或罕見。,M1,M2,M2a 骨髓中原粒細胞為30%-10%M2b骨髓中原粒、早幼粒細胞增多，以異常的中

27、性中幼粒細胞增生為主，其胞核常有核仁，有明顯的核漿發(fā)育不平衡，此類細胞>30%.,M3,以顆粒增多的異常早幼粒細胞增生為主，>30%(NEC),其胞核大小不一，胞漿中有大小不等的顆粒：M3a 粗顆粒型M3b 細顆粒型,M4,,M5,M5a 未分化型：骨髓中原單核細胞Ⅰ+Ⅱ（NEC) ≥80%M5b 部分分化型：骨髓中原始+幼稚單核細胞（NEC)>30%，原單核細胞Ⅰ+Ⅱ<80%,M6,骨髓中紅細胞系&g

28、t;50%，且有形態(tài)學異常，骨髓原粒細胞（NEC）或原始+幼稚單核細胞（NEC）Ⅰ+Ⅱ型>30%；若血片中原粒細胞或原單核細胞>5%,骨髓原粒細胞或原始+幼稚單核細胞>20%(NEC),M7,外周血中有巨核細胞；骨髓中原巨核細胞≥30%，該原巨核細胞應有電鏡或單克隆抗體證實；骨髓細胞少，往往干抽，活檢有原始和巨核細胞增多，網(wǎng)狀纖維增加。,關于雙系與雙表的定義,雙表型：白血病細胞均一，每個細胞能同時表達淋巴系細胞及髓系細