科室講座

1、流式細(xì)胞術(shù)在白血病中的臨床應(yīng)用,新疆自治區(qū)人民醫(yī)院檢驗(yàn)科莫紅梅,一、簡介流式細(xì)胞術(shù)二、簡介白血病三、流式細(xì)胞術(shù)在白血病中的應(yīng)用(結(jié)合病例分析),一、簡介流式細(xì)胞術(shù),1.流式細(xì)胞術(shù)（flow cytometry,FCM）：以流式細(xì)胞儀測(cè)量懸浮細(xì)胞的一種現(xiàn)代細(xì)胞分析技術(shù)。綜合運(yùn)用電子、激光、計(jì)算機(jī)和流體力學(xué)等與熒光標(biāo)記、分子免疫學(xué)、分子遺傳學(xué)及分子生物學(xué)等結(jié)合，對(duì)細(xì)胞的生理功能和特性進(jìn)行分析。,散射光信號(hào),Right A

2、ngle Light Detector ? Cell ComplexitySSC,Forward Light Detector ? Cell Surface Area FSC,Incident Light Source,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,前向角散射光（FSC, Forward Scatter）細(xì)胞相對(duì)大小及其表面積 側(cè)向角散射光（SSC,

3、 Side Scatter）細(xì)胞粒度及細(xì)胞內(nèi)相對(duì)復(fù)雜性,Laser,FALS Sensor,流式細(xì)胞儀的檢測(cè)信號(hào),熒光信號(hào)使用熒光標(biāo)記的單克隆抗體染色，做多色分析熒光信號(hào)的強(qiáng)弱，反映了細(xì)胞抗原的表達(dá)含量,熒光信號(hào),雙色直接染色,外周全血細(xì)胞散射光雙參數(shù)點(diǎn)圖（紅細(xì)胞溶解后）,二、簡介白血病,造血干細(xì)胞分化過程的不同階段發(fā)生分化阻滯、凋亡障礙和惡性增殖而引起的一組異質(zhì)性的造血系統(tǒng)惡性腫瘤。,1.白血病：常見的惡性腫瘤之一,根據(jù)白

4、血病細(xì)胞的成熟程度和自然病程：,急性：原始細(xì)胞、早期幼稚細(xì)胞為主，自然病程僅數(shù)月慢性：較成熟幼稚細(xì)胞和成熟細(xì)胞為主，自然病程常為數(shù)年,淋系、髓系（單核和粒細(xì)胞）急淋、急非淋（急性髓系白血?。┞堋⒙?根據(jù)主要受累的細(xì)胞系可分：,2、白血病的病因,放射因素化學(xué)因素病毒因素遺傳因素其它血液病：慢粒、真性紅細(xì)胞增多癥、原發(fā)性血小板增多癥、骨髓纖維化、MDS、PNH、淋巴瘤、MM,3、發(fā)病率,占癌癥發(fā)病率的5%，我

5、國發(fā)病率2-4/10萬，美國9.6/10萬，歐洲4.3-9.0/10萬。,我國白血病的流行現(xiàn)狀及特點(diǎn),急性：慢性5.5：1急性髓系白血病最多，其次急淋、慢粒，慢淋少成人急白以急粒為多見兒童以急淋為多見慢粒白血病隨年齡增長發(fā)病率逐漸升高慢淋在50歲以后才明顯增多男性略高于女性1.18：1,現(xiàn)有的分型：,FAB1976年形態(tài)分類1985-1986MIC:MorphologyImmunolog

6、y Cytogenetics WHO1995-1997細(xì)胞遺傳學(xué)NCI1990,FAB1991年修訂：急性髓系白血病,M0 急性髓系白血病微分化型M1急性粒細(xì)胞白血病未分化型M2急性粒細(xì)胞白血病部分分化型M3急性早幼粒細(xì)胞白血病M4急性粒單核細(xì)胞白血病M5急性單核細(xì)胞白血病M6紅白血病M7急性巨核白血病,急性淋巴細(xì)胞白血病,B細(xì)胞系T細(xì)胞系,4、臨床特點(diǎn),起病：發(fā)病急驟或緩慢起病急者

7、往往可沒有前驅(qū)癥狀，突然發(fā)病，以發(fā)熱、多部位出血、進(jìn)行性蒼白或骨、關(guān)節(jié)疼痛等為首發(fā)癥狀。起病緩慢者以蒼白、乏力、虛弱和食欲減退等癥狀開始，可進(jìn)行性加重，以后多有發(fā)熱、出血等。,發(fā)熱是最常見癥狀。感染原因：中性粒細(xì)胞減少或缺乏；中性粒細(xì)胞功能異常；免疫功能尤其是細(xì)胞免疫功能低下，或化療、糖皮質(zhì)激素的應(yīng)用；白血病細(xì)胞在全身各臟器廣泛浸潤，尤其是高白細(xì)胞浸潤后使組織缺氧，局部組織出血、壞死，增加了細(xì)菌滋生機(jī)會(huì)?？股氐氖褂貌?/p>

8、正確，尤其是條件致病菌及真菌的感染,發(fā)熱和感染,急白：幾乎所有患者都有不同程度出血，其中以M3和M5出血重。慢性白血病:不常見原因：血小板質(zhì)和量異常DIC :M3易發(fā)生凝血因子缺乏,出血,原因：骨髓中紅細(xì)胞系的造血被白血病細(xì)胞增殖所替代或受到白血病細(xì)胞分泌的抑制因子所抑制，使骨髓中紅細(xì)胞的生成減少，并使幼稚紅細(xì)胞對(duì)紅細(xì)胞生成素的反應(yīng)減弱。無效紅細(xì)胞生成；幼稚紅細(xì)胞增生異常。溶血：多見于ALL、CLL,急白合并DIC時(shí)常有

9、微血管病性溶血。其它：急慢性失血及某些抗代謝化療藥物,貧血,白血病細(xì)胞大量繁殖，使骨髓內(nèi)張力增高而發(fā)生疼痛；白血病細(xì)胞也可浸潤骨皮質(zhì)和骨膜，發(fā)生局部腫塊，還可以引起骨皮質(zhì)破壞缺損引起疼痛；白細(xì)胞壞死引起高尿酸血癥致痛風(fēng)、融骨性粒細(xì)胞肉瘤等，均可引起骨痛。肢體劇烈疼痛多見于ALL,兒童白血病多浸潤關(guān)節(jié)，成人主要疼痛部位在胸骨、肋骨及脊椎等。,骨、關(guān)節(jié)疼痛,神經(jīng)系統(tǒng)白血病細(xì)胞常可侵及中樞神經(jīng)系統(tǒng)，以蛛網(wǎng)膜及硬腦膜的浸潤常見。,

10、消化系統(tǒng)消化道的出血常見,肝、脾、淋巴結(jié)腫大急白的淋巴結(jié)腫大多為表淺的輕度腫大，質(zhì)地較軟，多局限在頜下、頸部、腹部及腹股溝等處。絕大多數(shù)T-ALL有縱膈淋巴結(jié)的腫大，但較少引起氣管、頸靜脈壓迫等癥狀。巨脾主要見于CML晚期及其急變、幼淋巴細(xì)胞白血病。,呼吸系統(tǒng)肺部浸潤以AML多見，侵犯胸膜發(fā)生胸腔積液以ALL多見，亦可見于AML-M5,多為血性，可見較多白血病細(xì)胞。,泌尿系統(tǒng),心臟五官及口腔白血病細(xì)胞浸潤口

11、腔黏膜可引起牙齦腫脹增生、巨舌、牙齦出血及口腔潰瘍，以AML-M4和M5最常見；眼眶與球后為綠色瘤的好發(fā)部位。乳腺 綠色瘤 常見于兒童和青年AML患者，尤以M2b多見，少數(shù)以綠色瘤為首發(fā)。綠色瘤浸潤之處皆呈綠色，是由于含大量的過氧化物酶所致。,電解質(zhì)紊亂低鉀血癥是AML于ALL常見的并發(fā)癥，于溶菌酶增高有關(guān)，血及尿中溶菌酶增高損傷腎小管，使近曲小管功能不全，鉀離子排出增多。低鈉血癥高鉀血癥低鈣血癥

12、高磷血癥,3.流式細(xì)胞免疫分型的發(fā)展史,1968年——第一臺(tái)流式細(xì)胞儀 美國斯坦福大學(xué)80年代中期——MIC分型我國：1988年——北京大學(xué)人民醫(yī)院購入1990年——白血病免疫分型臨床應(yīng)用,二、FCM在白血病診斷、治療中的應(yīng)用,白血病分型是白血病的診斷、選擇化療方案、判斷預(yù)后的重要依據(jù),外周全血細(xì)胞散射光雙參數(shù)點(diǎn)圖（紅細(xì)胞溶解后）,1.CD45的臨床應(yīng)用,CD45是白細(xì)胞的共同抗原成分。其分子量介于180—22

13、0Kda之間，屬于T200家族。所有人類白細(xì)胞均表達(dá)CD45，包括淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、多形核細(xì)胞、嗜酸、嗜堿性細(xì)胞、胸腺細(xì)胞、脾細(xì)胞、扁桃腺細(xì)胞以及骨髓前體細(xì)胞。,造血系統(tǒng)細(xì)胞CD45表達(dá)量與細(xì)胞分化程度的高低緊密相關(guān),即：分化程度高的細(xì)胞CD45表達(dá)量高，分化程度低的細(xì)胞CD45表達(dá)量低（淋巴細(xì)胞>單核細(xì)胞>成熟粒細(xì)胞>原幼細(xì)胞，在紅細(xì)胞中不表達(dá)；SSC是側(cè)向角參數(shù)，反應(yīng)細(xì)胞的顆粒度（成熟粒細(xì)胞>單核細(xì)胞>

14、;原幼細(xì)胞>淋巴細(xì)胞）。目前，國際上采用CD45—SSC設(shè)門（Gating），可非常輕松地將白血病細(xì)胞與正常細(xì)胞分開，增加白血病免疫分型的準(zhǔn)確性,正常人骨髓有核細(xì)胞免疫表型散點(diǎn)圖,2.FCM在白血病中的應(yīng)用優(yōu)勢(shì),▲能正確區(qū)別AML和ALL，并能進(jìn)一步區(qū)別ALL中的T系和B系及亞型▲能正確鑒別AML中難于鑒別的M0、M6、M7▲診斷雙系或雙表型白血病▲發(fā)現(xiàn)僅表達(dá)個(gè)別次要非本系列相關(guān)抗原的白血病▲診斷少見疑難白血病（如HCL）

15、,正常BM各系細(xì)胞比率,淋巴20-25%: T: 70%, B: 20%, NK:10%;單核2-6%粒細(xì)胞:40-60%有核紅:20-25%,急性B淋巴細(xì)胞白血病（B-ALL）R2：95.15%，CD33,HLA-DR,CD19,CD22,CD10 陽性,,正常B細(xì)胞標(biāo)志,泛B標(biāo)志：CD19,HLA-DR,cCD79a/CD22幼稚B標(biāo)志：CD34,TdT,CD10成熟B標(biāo)志：CD23,FMC7,B-ALL的分

16、型,2個(gè)月后復(fù)查:R3:73.94%CD33,HLA-DR,CD19, CD22,CD10,CD34陽性,R2：15.14%CD33,HLA-DR,CD19,CD10,CD34,CD22陽性，部分細(xì)胞表達(dá)CD20,,急性T淋巴細(xì)胞白血?。═-ALL）骨髓細(xì)胞免疫分型散點(diǎn)圖,,正常T細(xì)胞標(biāo)志：根據(jù)在胸腺內(nèi)發(fā)育階段分類,T-ALL的分型,預(yù)后,B-ALL及急性早期B前體細(xì)胞白血病的預(yù)后差，C-ALL的預(yù)后較好。T細(xì)胞系A(chǔ)LL的預(yù)后一般

17、講，小兒T細(xì)胞系A(chǔ)LL預(yù)后較差，而成人此型的預(yù)后較好。染色體分析對(duì)ALL尤其是兒童ALL有重要的預(yù)后價(jià)值?；旌闲虲LL預(yù)后及治療效果比CLL差。,正常單核細(xì)胞標(biāo)志,全單核細(xì)胞標(biāo)志：CD33,CD13,HLA-DR幼稚單核細(xì)胞標(biāo)志：CD34,CD117成熟單核細(xì)胞標(biāo)志：CD14,CD64,正常人骨髓有核細(xì)胞免疫表型散點(diǎn)圖,正常粒細(xì)胞標(biāo)志,成熟粒、單核細(xì)胞主要區(qū)別,成熟粒細(xì)胞：CD33+ HLA-DR- CD14- CD64+di

18、m成熟單核細(xì)胞：CD33++ HLA-DR+ CD14+ CD64++,R2:48.18%CD33,HLA-DR,CD34,CD15,CD14,CD64,CD11b,CD13陽性，部分細(xì)胞表達(dá)CD117,,R3:44.36%CD33,HLA-DR,CD34,CD15,CD117,CD38,CD13陽性,,病例一,某男，49歲，漢，以“咳嗽、咳痰、氣短40天”為主訴入院。血常規(guī)：WBC:33.5×109/L, HB

19、 62g/L,RBC 1.87×1012/L PLT:51×109/L, N 4.3%, L 90% M 5.4%,骨髓白血病免疫分型結(jié)果：,R1:98.80%陽性表達(dá)：CD33:87.36%, CD13:46.67%, CD38:22.68% CD34:92.49% , HLA-DR:83.99%,, CD19:98.08%, CD10:58.70% , CD20:34.09%, CD22:54.92%,

20、,骨髓形態(tài)：有核細(xì)胞增生活躍，粒系增生受抑制，紅系增生活躍，淋巴細(xì)胞增生明顯活躍，占81%，其中原始及幼稚淋巴細(xì)胞分別占10%和58%。,治療一個(gè)療程(長春地辛+去甲氧柔紅霉素+地塞米松)后復(fù)查骨髓免疫分型,R2:83.14%陽性表達(dá)：CD33:99.53%, CD13:56.26%, CD38:24.47% CD34:98.44% , HLA-DR:99.68%,, CD19:99.39%, CD10:99.42% , CD2

21、0:54.47%, CD22:84.24%,,第二個(gè)療程加用阿糖胞苷，2個(gè)月后復(fù)查骨髓免疫分型（急性白血病雙表型）,,,,,病例二,某男，21歲，哈族，以“間斷發(fā)熱，伴頭暈、乏力一個(gè)月”為主訴入院。查體：重度貧血貌，右側(cè)腹股溝處觸及2個(gè)0.5*1cm大小淋巴結(jié)，邊清，活動(dòng)可，質(zhì)中，無壓痛，余（-）T：39.6℃，WBC: 1.3×109/L, HB 73g/L, PLT:94×109/L,,骨髓免疫分型,形態(tài)

22、：有核細(xì)胞增生極度活躍，粒系增生極度活躍，占96%，以異常早幼粒細(xì)胞增生為主。診斷：M3a,6個(gè)月后復(fù)查：,,急性早幼粒細(xì)胞白血?。ˋML-M3）骨髓細(xì)胞免疫分型散點(diǎn)圖,某男，73歲，漢，以“發(fā)現(xiàn)雙側(cè)頸部淋巴結(jié)腫大1周”為主訴入院。血常規(guī)：WBC:6.49×109/L, HB 80g/L, PLT:214×109/L, N 57.1%, L 33.4% M 7.9% , IgM 32.3g/L,病例三,骨髓白血

23、病免疫分型結(jié)果：,R1：61.41%陽性表達(dá)：CD19, CD22,HLA-DR, CD20, CD38,FMC-7, CD23, CD5,病理結(jié)果：B小淋巴細(xì)胞淋巴瘤注意與其它慢性B淋巴細(xì)胞增殖性疾病的鑒別,病例四：多毛細(xì)胞白血病,典型為外周血全血細(xì)胞減少，脾大。血涂片中細(xì)胞具有明顯的特征：為中等大小的淋巴細(xì)胞，核/質(zhì)比中等。胞質(zhì)亮藍(lán)，邊緣不清，具有細(xì)且不規(guī)則的“毛”狀胞質(zhì)突起。,,R2:14.60%CD19,CD103,C

24、D20,CD22,HLA-DR,FMC-7,CD23,CD25陽性,診斷白血病主要標(biāo)志：,B-ALL: CD34, HLA-DR, CD19, CD10+/-, cCD79aT-ALL: CD34, CD38, CD7, CD2+/-, CD5+/-, cCD3AML: CD34, CD117, CD33, CD13, cMPO M2: CD19+: t(8, 21) M3: CD34-, HLA-DR- M4/

25、M5: CD14+ M6: GlyA+, CD71+ M7: IIb/IIIa(CD41, CD61)+,免疫分型對(duì)下列情況具有重要意義,用形態(tài)學(xué)、細(xì)胞化學(xué)染色不能肯定細(xì)胞來源的白血病。形態(tài)學(xué)為急性淋巴細(xì)胞白血?。ˋLL）或急性未分化白血?。ˋUL）但缺乏特異性淋巴細(xì)胞系列抗原標(biāo)記。混合性白血病。部分髓系白血病。目前，免疫分型對(duì)粒-單核細(xì)胞和單核細(xì)胞白血病的鑒別尚有一定困難。慢性淋巴細(xì)胞白血病。微小殘留白血病。,原始細(xì)

26、胞≥90%，胞漿大多透亮或中度嗜堿，無嗜天青顆粒及Auer小體，核仁明顯，類似All-L2型；細(xì)胞化學(xué)過氧化物酶及蘇丹黑B染色<3%；CD33或/及CD13陽性。淋系抗原陰性，但可有CD7+、TdT+；電鏡過氧化物酶陽性。,M0,原粒細(xì)胞（Ⅰ+Ⅱ 型） ≥90%(NEC), 早幼粒細(xì)胞很少，中幼粒細(xì)胞以下階段不見或罕見。,M1,M2,M2a 骨髓中原粒細(xì)胞為30%-10%M2b骨髓中原粒、早幼粒細(xì)胞增多，以異常的中

27、性中幼粒細(xì)胞增生為主，其胞核常有核仁，有明顯的核漿發(fā)育不平衡，此類細(xì)胞>30%.,M3,以顆粒增多的異常早幼粒細(xì)胞增生為主，>30%(NEC),其胞核大小不一，胞漿中有大小不等的顆粒：M3a 粗顆粒型M3b 細(xì)顆粒型,M4,,M5,M5a 未分化型：骨髓中原單核細(xì)胞Ⅰ+Ⅱ（NEC) ≥80%M5b 部分分化型：骨髓中原始+幼稚單核細(xì)胞（NEC)>30%，原單核細(xì)胞Ⅰ+Ⅱ<80%,M6,骨髓中紅細(xì)胞系&g

28、t;50%，且有形態(tài)學(xué)異常，骨髓原粒細(xì)胞（NEC）或原始+幼稚單核細(xì)胞（NEC）Ⅰ+Ⅱ型>30%；若血片中原粒細(xì)胞或原單核細(xì)胞>5%,骨髓原粒細(xì)胞或原始+幼稚單核細(xì)胞>20%(NEC),M7,外周血中有巨核細(xì)胞；骨髓中原巨核細(xì)胞≥30%，該原巨核細(xì)胞應(yīng)有電鏡或單克隆抗體證實(shí)；骨髓細(xì)胞少，往往干抽，活檢有原始和巨核細(xì)胞增多，網(wǎng)狀纖維增加。,關(guān)于雙系與雙表的定義,雙表型：白血病細(xì)胞均一，每個(gè)細(xì)胞能同時(shí)表達(dá)淋巴系細(xì)胞及髓系細(xì)