碭山酥梨肉桂酸4-羥化酶基因克隆及表達分析.pdf

1、苯丙烷途徑是植物特有的次生代謝途徑，也是植物三大次生代謝途徑之一。在維管植物中，苯丙烷途徑的終產物主要用于合成木質部的木質素單體和黃酮類物質。肉桂酸4-羥化酶(Cinnamate4-hydroxylase, EC1.14.13.11)屬于細胞色素單加氧酶超家族中的CYP73A亞家族。C4H是公共苯丙烷途徑的第2個關鍵酶，在整個途徑中起著十分重要的作用。它催化反式肉桂酸的羥化反應形成4-羥基肉桂酸。
　　為研究碭山酥梨木質素代謝過程

2、中C4H的作用，本研究克隆碭山酥梨C4H的cDNA全長，并進行生物信息學、原核表達和實時熒光定量表達分析；通過構建其真核表達載體，進行C4H蛋白定位和遺傳轉化研究。以期為利用分子生物學技術調控梨木質素的合成和石細胞的發(fā)育奠定了基礎。主要研究結果如下：
　?。?）克隆碭山酥梨肉桂酸4-羥基化酶基因的全長cDNA序列，命名為PbC4H， GenBank登錄號為KF663548。PbC4H全長1764 bp，具有1515 bp的開放閱讀

3、框(ORF)，編碼504個氨基酸。
　　（2）生物信息學分析表明，PbC4H相對分子量為57.8 kD，等電點(pI)為9.05。PbC4H與多個物種C4H編碼的氨基酸序列具有較高的同源性，說明其在進化過程中較為保守。結構域分析表明，PbC4H具有跨膜結構域和典型的細胞色素P450結構域特征。
　　（3）實時熒光定量PCR檢測表明，在自然授粉酥梨果實發(fā)育過程中，PbC4H的相對表達量高峰期在31d和55d，出現(xiàn)在石細胞、木質

4、素含量高峰期之前。不同品種授粉導致PbC4H的相對表達量發(fā)生改變，其中碭山酥梨(♀)×圓黃(♂)果實中PbC4H表達量高峰期在花后31d和47d，碭山酥梨(♀)×鴨梨(♂)果實中PbC4H表達量高峰期在花后31d和79d。
　?。?）構建了PbC4H原核表達載體pET-32a-PbC4H，在大腸桿菌BL21菌株中誘導表達了PbC4H融合蛋白。
　?。?）構建了植物表達載體 pCAMBIA1304-PbC4H和反義 RNA表達