油藏微生物烷烴羥化酶基因的全長克隆及序列分析.pdf

1、一些油藏微生物可以原油作為唯一碳源生長，其中的一些微生物在代謝過程中降解原油的部分組分，改變原油的流動性，從而提高殘余油的采收率。這些微生物在提高石油采收率和石油污染治理中具有重要應(yīng)用價(jià)值。目前，國內(nèi)關(guān)于烷烴好氧降解途徑中的關(guān)鍵酶基因——烷烴單加氧酶基因alkB和環(huán)境中烷烴降解菌的檢測研究較少。對烷烴單加氧酶基因的研究可以為提高石油采收率，生物修復(fù)和生物催化提供理論依據(jù)。烷烴降解菌的檢測則有助于石油勘測及評價(jià)環(huán)境中石油污染的程度。

2、>　　 根據(jù)相同種屬的烷烴單加氧酶基因設(shè)計(jì)引物，從Rhodococcus erythropolisT7-2克隆到四個(gè)烷烴單加氧酶基因alkB1，alkB2，alkB3，alkB4，從G.stearothermophilus DM-2克隆到alkB2和alkB3基因，未得到全長的alkB1和alkB4基因。為了獲得alkB兩翼的全長序列，本文用TAIL-PCR的方法簡單快速地克隆到DM-2四個(gè)完整的alkB基因及其側(cè)翼序列，并詳細(xì)分析了

3、四個(gè)alkB基因域，四個(gè)alkB基因的啟動子區(qū)域，以及alkB基因側(cè)翼的輔酶，并為以后構(gòu)建alkB基因的缺失載體提供基礎(chǔ)。
　　 alkB1基因下游為編碼紅素氧還蛋白的基因rubA1和rubA2及編碼紅素氧還蛋白還原酶的基因rubB。alkB2基因下游為編碼rubA3和rubA4的基因。紅素氧還蛋白和紅素氧還蛋白還原酶組成了烷烴氧化途徑中的電子傳遞系統(tǒng)。alkB3基因的上下游為編碼未知功能蛋白的基因。alkB4基因的上游序列編碼

4、推定的乙酸水解酶家族蛋白，下游序列編碼谷氨酰－tRNA合成酶。DM-2的四個(gè)alkB基因在Pseudomonas fluorescens KOB2Δ1和E.coli GEc137(pGEc47ΔB)中的功能互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)證實(shí)四個(gè)基因均可以在Pseudomonas fluorescens KOB2Δ1(不能在C12-C16為唯一碳源的培養(yǎng)基中生長)得到互補(bǔ)表達(dá)，說明克隆到的四個(gè)基因?yàn)榫哂谢钚缘耐闊N單加氧酶基因。
　　 對四個(gè)烷烴單加氧酶

5、的蛋白序列分析表明四個(gè)烷烴單加氧酶屬于跨膜蛋白，AlkB1和AlkB2有六個(gè)跨膜區(qū)，AlkB3和AlkB4有五個(gè)跨膜區(qū)，每個(gè)跨膜區(qū)均有22個(gè)氨基酸(AlkB4的兩個(gè)跨膜區(qū)除外)。四個(gè)蛋白具有AlkB類烷烴單加氧酶保守區(qū)域的His-1，His-2，His-3和HYG四個(gè)組氨酸模序。
　　 根據(jù)烷烴單加氧酶基因alkB保守區(qū)域設(shè)計(jì)不同的兼并引物，用兼并PCR從G. stearothermophilus DM-2，Rhodococcu