乙肝診斷治療分子指標

1、慢性乙型肝炎診斷與治療中的分子指標,楊志軍,乙型肝炎病毒感染的現(xiàn)狀,全球約有3.5億人感染乙型肝炎病毒，中國有1.2億人感染，其中每年約有1-2%會出現(xiàn)肝硬化或肝癌而死亡,HBV病毒顆粒感染肝細胞及DNA復制過程,慢性乙肝的診斷,HBsAg持續(xù)陽性6個月以上HBV-DNA高于105拷貝/毫升ALT持續(xù)升高或反復升高,慢性乙肝的分類,HBeAg陽性乙肝：HBsAg、HBeAg陽性； HBV-DNA高于105拷貝/毫升；ALT持續(xù)升高

2、或反復升高HBeAg陰性乙肝：HBsAg、anti-HBe陽性； HBV-DNA高于104拷貝/毫升；ALT持續(xù)升高或反復升高,診斷慢性乙肝的指標,生化指標：ALT免疫學指標：HBsAg（攜帶指標）、HBeAg（活動指標）病毒學指標：HBV-DNAHBeAg陰性乙肝缺乏病毒活動的免疫學指標，前S1可以彌補這一缺憾，提供HBeAg陰性乙肝患者病毒活動的免疫學指標,HBV-DNA檢測的基本要求,雖然國內(nèi)HBV-DNA檢測都用實時熒光

3、PCR法，但不同廠家的產(chǎn)品定量標準的賦值有差異，從而導致定量結果的差異，而準確的定量結果直接影響到對病人的診斷以及治療方案的選擇HBV DNA定量試劑的溯源和標準化將是一種基本趨勢,慢性乙肝治療的長期目標,防止發(fā)展成為肝硬化或肝細胞癌在臨床上，往往以比較現(xiàn)實的短期目標來代替長期目標,慢性乙肝治療的短期目標,病毒抑制：表現(xiàn)為HBeAg血清轉換和HBV-DNA陰轉肝損傷程度降低：表現(xiàn)為轉氨酶恢復正常完全清除病毒：表現(xiàn)為HBsAg消失

4、，HBsAb出現(xiàn)，血清和肝細胞中檢測不到HBV-DNA從目前水平來看，不可能完全清除病毒,治療慢性乙肝的藥物,免疫調(diào)節(jié)劑：干擾素、PEG干擾素、胸腺肽核苷類似物：拉米夫定、阿德福韋、替比夫定、恩替卡韋、泰諾福韋等,拉米夫定治療與轉氨酶濃度,拉米夫定治療一年后的HBeAg陰轉率和HBV-DNA陰轉率： ALT濃度低于2倍正常值高限：5% ALT濃度介于2-5倍正常值高限：26% ALT濃度高于

5、5倍正常值高限：64%,HBV-DNA定量檢測的臨床應用,慢性乙肝診斷治療監(jiān)測和療效評價跟蹤隨訪預后判斷,HBV-DNA定量— 慢性乙肝的診斷,HBsAg陽性六個月以上ALT持續(xù)升高或反復升高HBV-DNA大于105拷貝/毫升（HBeAg陽性）或104拷貝/毫升（HBeAg陰性）,HBV-DNA定量— 抗病毒治療的條件,ALT高于2×ULN（正常值上限）HBV-DNA大于105拷

6、貝/毫升（HBeAg陽性）或104拷貝/毫升（HBeAg陰性）ATL持續(xù)正常的患者可暫不進行治療，每隔3-6個月隨訪肝功能、血清病毒學標志物和進行肝細胞肝癌監(jiān)測 ALT水平在1-2倍ULN之間，需根據(jù)具體情況(如肝活檢結果等)， 在告知患者治療的利與弊、了解患者配合程度的前提下，決定是否實施治療。無論治療與否均應密切隨訪，為治療提供更為科學的根據(jù),HBV-DNA定量— 慢性乙肝的治療監(jiān)測,治療前檢測患者的基線水平（

7、ALT、HBV-DNA）治療開始后前三個月每月一次、以后每三個月一次檢測ALT、HBV-DNA，對于HBeAg陽性患者，還需檢測HBeAg如果治療期間HBV-DNA水平降低兩個數(shù)量級，可以認為治療有效,HBV-DNA定量— 療效評價（1）,生化學應答：完全應答：2次監(jiān)測ALT均復常(間隔1個月)；無應答：ALT未恢復正常。值得注意的是評價生化學應答時應排除其他藥物或疾病對ALT升高或下降的影響,HBV-DNA定量—

8、 療效評價（2）,病毒學應答：完全應答按所采用的HBV DNA檢測方法說明書上提供的實驗敏感性和檢測范圍確定，臨床上一般認為采用國際公認的檢測方法或敏感性相當?shù)臋z測方法檢測HBV DNA定量<105拷貝/毫升或斑點雜交法陰性為完全應答；部分應答為未達完全應答標準但HBV DNA載量下降大于2個對數(shù)級；無應答為未達上述標準,HBV-DNA定量— 療效評價（3）,血清免疫學應答：完全應答為HBeAg

9、/抗HBe血清轉換；部分應答為HBeAg陰轉但未出現(xiàn)抗HBe；無應答為未達上述標準。,HBV-DNA定量— 綜合療效評價（1）,完全應答為療程結束時，生化學、病毒學和血清免疫學所有指標均達到完全應答,HBV-DNA定量— 綜合療效評價（2）,部分應答為療程結束時，生化學、病毒學和血清免疫學指標介于完全應答和無應答之間,HBV-DNA定量— 綜合療效評價（3）,無應答為療程結束時，生化

10、學、病毒學和血清免疫學指標均為無應答 HBeAg陰性伴HBV DNA活躍復制的慢性乙型肝炎患者不進行血清免疫學應答評價，但應進行生化學和病毒學指標的療效評價,HBV-DNA定量— 何時可以停藥（1）,治療前HBeAg陽性的患者，治療1年時綜合療效達到完全應答者建議至少繼續(xù)用藥6個月，期間每3個月1次復查ALT、HBVDNA、HBeAg/抗HBe，仍持續(xù)完全應答者可停藥觀察,HBV-DNA定量— 何時

11、可以停藥（2）,治療前HBeAg陽性的患者，治療1年時綜合療效達到部分應答者建議繼續(xù)用藥直至達到完全應答后，再繼續(xù)用藥至少6個月，期間每3個月1次復查ALT、HBV DNA、HBeAg/抗HBe，仍持續(xù)完全應答者可停藥觀察,HBV-DNA定量— 何時可以停藥（3）,治療前HBeAg陽性患者治療1年時綜合療效仍無應答可停藥觀察，或改用其他有效的抗病毒藥治療。對于有肝臟組織學檢查等其它臨床指征顯示病情進展合并肝功能失代償或

12、肝硬化的病人，不宜輕易停藥，并應加強對癥保肝治療,HBV-DNA定量— 何時可以停藥（4）,HBeAg陰性伴HBV DNA活躍復制的慢性乙型肝炎患者，綜合療效完全應答者療程至少2年；對于完成1年治療仍無應答者可改用或加用其他有效 治療方案,HBV-DNA定量— 治療后的隨訪,無論有否治療應答，都應對患者定期隨訪。建議停藥后的前3個月每月1次、以后每3～6個月1次檢測ALT、AST、HBV血清標志物和H

13、BV DNA，以及臨床表現(xiàn)和不良反應。隨訪至少6-12個月。如病情有變化，可隨時隨訪。,HBV拉米夫定耐藥,雖然拉米夫定治療慢性乙肝療效顯著，但長期使用拉米夫定會出現(xiàn)耐藥現(xiàn)象使用一年、二年、三年、四年的耐藥比率為：15-32%、38%、56%、67%一旦出現(xiàn)拉米夫定耐藥突變（YMDD變異），大多數(shù)患者會在2-4個月之內(nèi)出現(xiàn)HBV-DNA和ALT反彈,YMDD變異檢測,采用實時熒光定量PCR方法，不僅能夠檢測出現(xiàn)的突變類型（YVDD或

14、YIDD），而且能夠確定突變株所占比例，對及時調(diào)整治療方案具有非常重要的意義能夠準確穩(wěn)定的檢測到1%的突變株，能夠更早發(fā)現(xiàn)耐藥突變，盡早調(diào)整治療方案,HBV 拉米夫定耐藥突變檢測試劑原理,HBV檢測I突變檢測V突變檢測,YMDD的定量檢測,采用選擇性引物，基于TaqMan實時PCR技術，在三個平行反應中分別擴增總HBV(C管）、YIDD（I管）、YVDD（V管），根據(jù)管間Ct值差異計算突變毒株在病毒群體中的比例,YMDD的

15、定量檢測,YMDD的定量檢測,YMDD的定量檢測,YMDD的定量檢測,YMDD的定量檢測,與其它方法的比較,Comparison of results obtained by sequencing, pyrosequencing and real-time PCRTypesSequencingpyrosequencingreal-time PCRrtM20425 (36%)24 (35%)23 (33%)rtM204

16、I26 (38%)24 (35%)21 (30%)rtM204V18 (26%)19 (27%)20 (29%)rtM204I + rtM204V02 (3%)5 (8%),YMDD變異定性判斷的臨界值,定性判斷：ΔCt < 3.5，此時病毒群體中突變株比例大于10%與測序法比較，15例標本結果完全符合,YMDD變異定性判斷的臨界值,什么時候開始檢測YMDD變異,拉米夫定治療過程中YMDD變異情況治療

17、時間 HBV DNA大于104copies/ml例數(shù) YMDD變異例數(shù)*< 6個月61（17%）6~12個月2614（54%）12~24個月3826（68%）24~36個月3838（100%）* 各組之間兩兩比較均有顯著差異（P<0.05）。,YMDD變異株的動態(tài)變化,YMDD變異株的動態(tài)變化,YMDD檢測試劑—應用方法,對接受拉米夫定治療的慢性乙肝患者進行耐藥監(jiān)測治

18、療前檢測一次（約有10-20%的人在治療前就有YMDD變異）治療開始后第七個月開始，每三個月檢測一次拉米夫定耐藥、替比夫定耐藥（YIDD）恩替卡韋治療YMDD變異患者存在耐藥高風險,慢性乙肝的基因分型,乙肝病毒分八個基因型：根據(jù)基因組序列的差異可以分為A～H八種亞型，我國以B型（41%）和C型（53%）為主不同基因型病毒感染的病程和后果不同：C型對肝的損傷比B型嚴重，基因型C比基因型B更容易發(fā)展成為肝硬化不同的基因型對藥物的應

19、答也不一樣：基因型B比基因型C對干擾素治療的應答率高,HBV基因分型PCR檢測試劑,運用多重、多色實時PCR技術，分別對乙肝病毒（HBV）各種基因型序列進行分析根據(jù)國內(nèi)HBV基因型的特點，設計能檢測HBV A~D四種基因型特異性引物及探針研制開發(fā)具有自主知識產(chǎn)權的乙肝病毒（HBV）基因分型多重、多色實時PCR檢測試劑盒,HBV基因分型—結果判斷方法,HBV基因分型—分型識別率,分型識別率＝（12+22）/35＝97％,HBV基因

20、分型—分型靈敏度（1）,HBV B型血清樣本靈敏度約在2×103IU/ml,HBV基因分型—分型靈敏度（2）,HBV C型血清樣本靈敏度約在1×103IU/ml,共價閉合環(huán)狀DNA (cccDNA)檢測,HBV cccDNA是乙肝病毒前基因組RNA復制的原始模板只有徹底清除了cccDNA，乙肝的治療才能算真正有效HBV cccDNA可作為評價抗病毒治療效果新的有效指標,HBV cccDNA PCR檢測試劑,運

21、用實時PCR技術，根據(jù)乙肝病毒共價閉合環(huán)狀DNA（cccDNA）和雙鏈松弛環(huán)狀DNA（rcDNA）分子結構上的差異，即rcDNA負鏈上的缺口和正鏈的不完整性，設計一對特異性cccDNA的引物，分別雜交于1500和2100鄰近區(qū)域(以EcoR I切點為物理起始原點)，同時設計一條雜交于負鏈3’端近缺口處檢測探針，研制開發(fā)具有自主知識產(chǎn)權的HBV cccDNA實時PCR檢測試劑盒。,HBV cccDNA檢測試劑原理,rcDNA不能被擴增無

22、熒光信號,cccDNA能被擴增檢測到熒光信號,阿德福韋治療乙型肝炎,阿德福韋為5’-單磷酸脫氧阿糖腺苷類似物，可明顯抑制HBV DNA復制 HBeAg陽性慢性乙型肝炎患者，1、2、3年時的耐藥發(fā)生率分別為0%、1.6%、3.1%HBeAg陰性者1、2、3年的耐藥發(fā)生率分別為0%、3.0%、5.9%~11%,阿德福韋耐藥突變位點,rtN236T、rtA181V/T,恩替卡韋治療乙型肝炎,拉米夫定耐藥的病毒株對恩替卡韋敏感性降低8至3

23、0倍；發(fā)生YMDD變異患者治療1 年時對恩替卡韋耐藥發(fā)生率為5.8%，并出現(xiàn)相關的位點變異。,恩替卡韋耐藥突變位點,如果乙肝病毒多聚酶存在rtL180M和/或rt M204V/I，rtT184，rtS202和/或rtM250等位點變異將造成對恩替卡韋耐藥,HBV耐藥與分型同時檢測,HBV耐藥與分型同時檢測,1896突變的診療意義,G1896A點突變，形成終止密碼子 (TAG)，不表達HBeAg；由于e抗原不能合成，血清中檢測不到HB

24、eAg，但乙肝病毒仍處于復制狀態(tài)；此類HBeAg陰性乙肝患者更容易發(fā)生嚴重的肝臟疾病，需接受更為長期的抗病毒治療。,基因檢測在乙肝診療各階段的應用,藥物治療方案的確定（用藥：干擾素、拉米夫定、阿德福韋、恩替卡韋）,藥物治療（療效評價）,前C區(qū)1896位點突變檢測試劑盒,跟蹤隨訪,,,,乙 肝 病 毒 定 量檢測 試 劑 盒,確診,病毒學分析,乙肝病毒分型檢測試劑盒,拉米夫定耐藥檢測試劑盒,阿德福韋耐藥檢測試劑盒,,,,共價閉合環(huán)