高速逆流色譜法_hsccc_分離制備香水蓮花中的柚皮素

1、第31卷第6期2012年12月中國野生植物資源ChineseWildPlantResourcesVol31No6Dec2012收稿日期:2012－06－30基金項(xiàng)目:國家“十一五”支撐計(jì)劃課題(2006BAD06B02)國家科技基礎(chǔ)條件平臺工作項(xiàng)目(2004DEA71010)作者簡介:姜洪芳，副研究員，從事植物有效物質(zhì)開發(fā)利用研究。E－mail:jhf74@163com通訊作者:張衛(wèi)明，研究員，博導(dǎo)，主要研究植物活性成分開發(fā)與應(yīng)用。E－

2、mail:botanyzhang@163comdoi:103969jissn1006－9690201206010高速逆流色譜法(HSCCC)分離制備香水蓮花中的柚皮素姜洪芳1，2，石寶俊2，趙伯濤2，張衛(wèi)明1，2(1南京師范大學(xué)，江蘇南京2100462南京野生植物綜合利用研究院，江蘇南京210042)摘要采用高速逆流色譜法對香水蓮花中的黃酮類化合物進(jìn)行了分離，溶劑系統(tǒng)為正己烷－醋酸乙酯－甲醇－水(體積比1∶12∶2∶1)，上層為固定相，

3、下層為流動相，流速20mLmin，轉(zhuǎn)速830rmin，檢測波長280nm，進(jìn)樣量300mg，分離出80mg化合物C，經(jīng)HPLC測定純度＞986%，根據(jù)UV光譜、MS分析及1H－NMR、13C－NMR圖譜分析結(jié)果，化合物C鑒定為柚皮素，該化合物為首次從該植物中分離得到，為香水蓮花的開發(fā)應(yīng)用提供了理論依據(jù)。關(guān)鍵詞高速逆流色譜法高效液相色譜法香水蓮花柚皮素中圖分類號:R2842文獻(xiàn)標(biāo)識碼:A文章編號:1006－9690(2012)06－004

4、0－04SeparationPreparationofNaringeninfromNymphaeahybridbyHighspeedCountercurrentChromatographyJiangHongfang1，2，ShiBaojun2，ZhaoBotao2，ZhangWeiming1，2(1NanjingNmalUniversity，Nanjing210046，China2NanjingInstitutefComprehensi

5、veUtilizationofWildPlants，Nanjing210042，China)AbstractTheflavonoidwassuccessfullyisolatedpurifiedfromNymphaeahybridbyhighspeedcountercurrentchromatography(HSCCC)withatwophasesolventsystemcomposedofnhexaneethylacetatemeth

6、anolwater(1∶12∶2∶1，vvvv)ThelowerphasewasusedasthemobilephasetheupperphasewasusedasthestationaryphaseTheflowratewas20mLmin，therevolutionspeedwas830rminthedetectionwavelengthwassetat280nmUndertheoptimizedconditions，within1

7、5h，80mgofcompoundⅠwiththepurityof986%byhighperfmanceliquidchromatography(HPLC)wasobtainedfrom300mgoftheelutionflowofsilicagelcolumnThestructurewasconfirmedasnaringeninbyusingmassspectrometry，1Hnuclearmagicresonance(1HNMR

8、)13CNMRThiscompoundwasobtainedfromtheplantfthefirsttimeKeywdshighspeedcountercurrentchromatography(HSCCC)highperfmanceliquidchromatography(HPLC)Nymphaeahybridnaringenin香水蓮花(Nymphaeahybrid)是睡蓮科(Nymphaea)睡蓮屬熱帶大型睡蓮，是一種多年生宿根

9、水生花卉，有很高的觀賞價(jià)值。香水蓮花花朵碩大、色彩鮮艷，香氣清雅宜人，集當(dāng)今世界各地荷、蓮珍貴品種之優(yōu)點(diǎn)于一身，因而成為備受青睞的園林水生觀賞花卉。近年來我國南方數(shù)省已開始引種，并且發(fā)展到了一定的規(guī)模。源于香水蓮花的各種產(chǎn)品也開始不斷開發(fā)，鮮花可供生食，亦可泡茶、浸酒或隨其他食物燉煮，以子房連同雄蕊一起經(jīng)高溫烘焙制成的香水蓮花茶，也有以其提取物制成的九品蓮花酒等等，均具有一定的保健作用［1－3］。動物實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證明香水蓮花具有降血脂、抗氧

10、化、抑制酪氨酸酶及預(yù)防酒精肝［4－7］等生物活性，但化學(xué)成分研究相對較少?！?4—中國野生植物資源第31卷根據(jù)色譜圖手動收集各峰組分，HPLC檢測其純度。分離結(jié)束后，停止轉(zhuǎn)動主機(jī)，用無水乙醇將分離管吹洗干凈。126HPLC分析條件及結(jié)構(gòu)鑒定HPLC色譜條件:EclipseXDB－C18分離柱(46mm150mm，5μm)流動相為甲醇∶10%磷酸=50∶50，流速為10mLmin柱溫為25℃，DAD檢測器，檢測范圍190～400nm進(jìn)樣量

11、10μL。HSCCC分離得到的組分的結(jié)構(gòu)根據(jù)質(zhì)譜、核磁共振氫譜(1H－NMR)和核磁共振碳譜(13C－NMR)的數(shù)據(jù)進(jìn)行鑒定。2結(jié)果與討論21HSCCC溶劑系統(tǒng)的優(yōu)化選擇溶劑系統(tǒng)是決定HSCCC分離樣品效果的最關(guān)鍵因素。不同的溶劑系統(tǒng)由于黏度、極性和密度等性質(zhì)的差異，對相同的成分會產(chǎn)生不同的溶解、分配能力，因而形成分配系數(shù)的差異。根據(jù)色譜理論，利用HSCCC分離樣品的必要條件是目標(biāo)物能穩(wěn)定的溶于兩相溶劑目標(biāo)物在兩相中具有合適的分配系數(shù)，

12、必須在05和2之間。若K遠(yuǎn)小于1，樣品會很快隨流動相流出，達(dá)不到分離效果若K遠(yuǎn)大于1，樣品的出峰時(shí)間會延長，形成寬峰。本研究根據(jù)香水蓮花提取物的目標(biāo)化合物C在不同組成比例的正己烷－乙酸乙酯－甲醇－水溶劑系統(tǒng)中的分配系數(shù)，從中優(yōu)選出具有合適分配系數(shù)的溶劑體系，結(jié)果見表1。表1化合物C在不同比例的溶劑體系中的分配系數(shù)(K)溶劑系統(tǒng)正己烷－乙酸乙酯－甲醇－水(VVVV)K11∶1∶1∶123121∶1∶2∶108631∶2∶15∶115341

13、∶12∶15∶113651∶12∶2∶1102注:K=AUAL由表1可見，在溶劑體系1、3、4條件下，化合物C的分配系數(shù)偏大，在固定相中的保留時(shí)間過長，不適合分離，而在2的條件下，化合物C易和不被保留的雜質(zhì)幾乎同時(shí)流出而沒有達(dá)到很好的分離，在溶劑體系5中，化合物C的分配系數(shù)接近1，而且所需分離時(shí)間較短，5是較為適宜的HSCCC分離溶劑體系。22HSCCC檢測波長的選擇化合物C的HPLC－DAD檢測圖譜(見圖1)可知，由220～230nm

14、、280～300nm2個(gè)較強(qiáng)的的吸收帶組成，320～340nm處的吸收帶為肩峰。雖然色譜峰在225nm吸收強(qiáng)度大，但由于樣品中的其他化合物及流動相(乙酸乙酯、甲醇等)在210～230nm下均有較強(qiáng)的吸收，在HSCCC分離中這種溶劑吸收帶來的基線背景吸收值過高，且影響基線的平穩(wěn)。因此，綜合考慮選擇HSCCC分離的檢測波長為280nm。圖1化合物C的HPLC－DAD檢測圖譜23HSCCC分離純化結(jié)果采用125節(jié)的條件對122中得到的108－

15、112流分進(jìn)行分離純化，分離時(shí)間為15h，固定相保留率為80%。根據(jù)HSCCC圖譜手動收集得到3個(gè)組分(見圖2)，經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn)其中A、B二峰均為雜質(zhì)峰，C峰較純。將其收集，濃縮干燥，質(zhì)量為80mg。圖2香水蓮花底層黃色物質(zhì)硅膠柱分離108－112流分的HSCCC分離圖24化合物C高效液相色譜檢測純度采用126節(jié)的條件，對23中的分離產(chǎn)物C峰進(jìn)行HPLC分析，結(jié)果見圖3。使用面積歸一法測定所得組分的純度為986%。圖3HSCCC分離所得化合