高速逆流色譜技術(shù)在天然產(chǎn)物分離制備中的探索性研究.pdf

1、目的：(1)建立單獨(dú)配制溶劑系統(tǒng)的固定相和流動(dòng)相的新方法，并將之用于天然產(chǎn)物的高速逆流色譜(High-speed counter-current chromatography.HSCCC)分離純化；(2)采用J型HSCCC系統(tǒng)和反膠團(tuán)溶劑體系對(duì)活性天然蛋白進(jìn)行分離純化。
　　 方法：(1-1)氣相色譜(GC)輔助單獨(dú)配制溶劑系統(tǒng)。采用GC色譜和內(nèi)標(biāo)法測(cè)定傳統(tǒng)配制的固定相和流動(dòng)相中各有機(jī)溶劑的含量，利用質(zhì)量參數(shù)計(jì)算水的含量。根據(jù)測(cè)

2、定結(jié)果分別計(jì)算固定相和流動(dòng)相中各溶劑的體積分?jǐn)?shù)，再單獨(dú)配制兩相溶劑，并將該法用于黃連(Coptis chinensisFranch)生物堿的分離純化。(1-2)UNIFAC數(shù)學(xué)模型-逆流色譜溶劑系統(tǒng)選擇(CCC-SSS)軟件單獨(dú)配制溶劑系統(tǒng)。根據(jù)UNIFAC數(shù)學(xué)模型計(jì)算各溶劑在溶劑系統(tǒng)上下相中的活度系數(shù)和摩爾百分比，再結(jié)合各試劑的密度和分子量計(jì)算出各試劑在上下相中的體積含量，以此來(lái)單獨(dú)配制兩相溶劑。并將該法用于穿山龍(Dioscorea

3、 nipponica Makino)和竹葉(Lophatherum gracile)中活性成分的分離純化。(2)采用兩性表面活性劑和有機(jī)溶劑建立的反膠團(tuán)溶液為固定相，磷酸鈉鹽緩沖液為流動(dòng)相，對(duì)來(lái)自菠蘿和螺旋藻中的菠蘿蛋白酶和藻藍(lán)蛋白進(jìn)行分離純化。
　　 結(jié)果：(1-1)在HSCCC分離純化黃連生物堿的過(guò)程中，使用GC輔助單獨(dú)配制的氯仿-甲醇-水(2：1：1，v/v/v)兩相溶劑系統(tǒng)成功分離出黃連堿、小檗堿、巴馬汀、表小檗堿和藥根

4、堿五種生物堿，其純度和回收率均分別大于98.5％和92.0%。在進(jìn)行等效HSCCC分離時(shí)，與傳統(tǒng)的溶劑配制方法相比，可以節(jié)約134mL氯仿、336mL甲醇和452mL水。(1-2)采用UNIFAC數(shù)學(xué)模型單獨(dú)配制的正己烷-乙酸乙酯-乙醇-水(2：5：2：5，v/v/v/v)成功用于穿山龍中薯蕷皂苷的分離制備；用此法單獨(dú)配制的乙酸乙酯-正丁醇-水(2：1：3，v/v/v)成功的從竹葉中分離純化了槲皮素-3-O-葡萄糖苷。此法與傳統(tǒng)的溶劑系

5、統(tǒng)配制方法相比，分離效率相當(dāng)，但節(jié)省了有機(jī)溶劑。(3)采用(0.1mol/LCTAB/正辛烷-止己醇)反膠團(tuán)溶液做固定相，以流動(dòng)相A(0.05mol/LNaH2PO4，pH=7.0，0.2mol/LKCl)進(jìn)行溶劑系統(tǒng)的動(dòng)態(tài)平衡，流動(dòng)相B(0.05mol/LNaH2PO4，pH=7.0，0.4mol/LKCI)進(jìn)行洗脫，成功的從菠蘿粗蛋白中分離出達(dá)到電泳純和質(zhì)譜純的菠蘿蛋白酶，回收率高達(dá)88.4%；同樣采用反膠團(tuán)溶液(0.1mol/LC

6、TAB/正辛烷-正己醇)做固定相，流動(dòng)相A(0.05mol/LNaH2PO4，pH=5.0，0.2mol/LKCl)和流動(dòng)相B(0.05mol/LNaH2PO4，pH=8.0，0.4mol/LKC1)成功的從螺旋藻粗蛋白中分離出藻藍(lán)蛋白，產(chǎn)物純度為A620/A280=4.25，回收率約85%。
　　 結(jié)論：(1)我們對(duì)新建的單獨(dú)配制模式配制的溶劑系統(tǒng)與傳統(tǒng)模式配制的溶劑系統(tǒng)在HSCCC分離過(guò)程中的固定相保留率、分離時(shí)間、固定相和