內(nèi)分泌干擾物TCDD與PCBs聯(lián)合暴露復(fù)合效應(yīng)代謝組學(xué)研究.pdf

1、內(nèi)分泌干擾物(endocrinedisruptors，EDs)是我國廣泛存在、危害效應(yīng)十分嚴(yán)重的環(huán)境與食品污染物。目前，EDs已成為全世界廣泛關(guān)注的安全衛(wèi)生問題之一，特別是其聯(lián)合暴露的復(fù)合效應(yīng)更是令人擔(dān)憂。2，3，7，8-四氯二苯并對二噁英(2，3，7，8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin，TCDD)和多氯聯(lián)苯類(polychlorinatedbiphenyls，PCBs)化合物是典型的EDs，由于它們廣泛分布并共

2、存于環(huán)境中，具有可生物蓄積、難以降解、遠(yuǎn)距離遷移及高毒等特性，已成為環(huán)境毒理學(xué)研究的熱點。但有關(guān)EDs的危險性認(rèn)識及相關(guān)毒理學(xué)研究主要關(guān)注單一污染物的效應(yīng)，且研究手段仍主要沿用傳統(tǒng)的毒性評價方法，而對于它們聯(lián)合暴露的復(fù)合效應(yīng)還沒有進行系統(tǒng)研究?；谖覈喾NEDs共存污染的現(xiàn)狀，應(yīng)用新技術(shù)開展對多種環(huán)境與食品污染物復(fù)合毒性效應(yīng)研究具有十分重要的理論和現(xiàn)實意義?；诤舜殴舱?nuclearmagneticresonance，NMR)的代謝組

3、學(xué)技術(shù)是近年來發(fā)展起來的新技術(shù)，已廣泛地應(yīng)用于毒理學(xué)研究。因此，本研究擬將代謝組學(xué)技術(shù)與傳統(tǒng)毒性評價技術(shù)相結(jié)合，對我國環(huán)境污染中危害較嚴(yán)重的內(nèi)分泌干擾物TCDD與PCBs聯(lián)合暴露的復(fù)合毒性效應(yīng)進行系統(tǒng)研究，探討復(fù)合效應(yīng)作用模式及作用機制，尋找復(fù)合效應(yīng)的候選生物標(biāo)志物，并探討代謝組學(xué)技術(shù)在EDs復(fù)合效應(yīng)研究中的應(yīng)用前景。 首先，建立針對EDs毒性研究的代謝組學(xué)技術(shù)平臺。采用2×2析因設(shè)計將20只SD大鼠隨機分為4組，即對照組、P

4、CBs單獨染毒組(Aroclor125410mg/kg)、TCDD單獨染毒組(TCDD10μg/kg)和聯(lián)合染毒組(TCDD10μg/kg+Aroclor125410mg/kg)，每組5只。灌胃染毒，每天1次，連續(xù)3d。用代謝籠收集各組大鼠染毒前、染毒過程中每天24h的尿液，對其進行核磁共振氫譜(1HNMR)分析，建立特征代謝譜，采用主成分分析法(principalcomponentanalysis，PCA)對結(jié)果進行統(tǒng)計分析。各組間進

5、行的PCA分析結(jié)果顯示，各樣本基本集中分布于得分圖的橢圓形(95％置信區(qū)內(nèi))的4個區(qū)域，各染毒組大鼠尿液代謝組軌跡能夠明顯地與對照組分開，單獨與聯(lián)合染毒組大鼠尿液代謝組軌跡也能明顯分開，提示各組大鼠尿液的代謝組都發(fā)生了明顯的改變。本研究表明，采用代謝組學(xué)方法能夠很好地表征和描述TCDD與PCBs聯(lián)合暴露導(dǎo)致的代謝變化，并能對其復(fù)合毒性效應(yīng)進行說明，表明已成功地建立了基于1HNMR的代謝組學(xué)技術(shù)平臺。代謝組學(xué)方法的靈敏性優(yōu)于傳統(tǒng)毒性評價方

6、法，該技術(shù)用于EDs復(fù)合效應(yīng)研究具有良好的應(yīng)用前景。 在此基礎(chǔ)上，本研究利用所建立的代謝組學(xué)技術(shù)平臺，結(jié)合傳統(tǒng)毒性評價方法對TCDD與PCBs聯(lián)合暴露復(fù)合毒性效應(yīng)進行了研究，觀察聯(lián)合暴露后大鼠尿液的代謝模式的變化及其與血液生化指標(biāo)和組織病理學(xué)的相關(guān)性，尋找復(fù)合效應(yīng)的候選生物標(biāo)志物，探討TCDD與PCBs聯(lián)合暴露毒性效應(yīng)機制。SD大鼠每天灌胃染毒1次，連續(xù)6d。用代謝籠收集各組大鼠尿液，測定1HNMR譜，并進行血清生化指標(biāo)、組織

7、病理學(xué)和組織氧化損傷檢測。結(jié)果表明，各染毒組大鼠均呈現(xiàn)不同程度的毒性效應(yīng)，表現(xiàn)為：體重下降、臟器系數(shù)與血清生化指標(biāo)改變、組織病理學(xué)改變以及組織發(fā)生氧化損傷，這些毒性效應(yīng)在聯(lián)合染毒組表現(xiàn)更為明顯。運用1HNMR代謝組學(xué)技術(shù)研究TCDD與PCBs聯(lián)合暴露對大鼠尿液代謝產(chǎn)物譜影響的結(jié)果表明：各組在不同染毒條件下的代謝模式可明顯區(qū)分開，自染毒第一天起，各染毒組大鼠的代謝組就明顯偏離對照組和染毒前的代謝組成分，且各染毒組的代謝組軌跡不同，提示其毒

8、性作用機制可能不同。大鼠尿液1HNMR譜改變及其相對位置與其毒性呈較強的對應(yīng)關(guān)系。通過對兩種評價方法結(jié)果的對比，可發(fā)現(xiàn)不同染毒代謝組的改變以及毒性發(fā)生發(fā)展過程中代謝組的改變均與常規(guī)毒性檢測指標(biāo)相符。尿樣1HNMR譜PCA分析結(jié)果表明，大鼠尿液中2-酮戊二酸、檸檬酸、琥珀酸、肌酸、乳酸、N-氧三甲胺(trimethylamine-N-oxide，TMAO)、馬尿酸、2-羥異戊酸、?；撬?、二甲胺(dimethylamine，DMA)、肌酐、

9、葡萄糖等代謝產(chǎn)物水平在染毒后發(fā)生了改變，且聯(lián)合暴露組的改變更明顯。這些改變了的代謝成分可能成為研究復(fù)合毒性效應(yīng)候選生物標(biāo)志物。另外，提示聯(lián)合暴露的毒性效應(yīng)可能與線粒體功能受損、三羧酸循環(huán)的能量代謝異常以及葡萄糖、脂肪和氨基酸代謝紊亂有關(guān)。 進而對TCDD和PCBs聯(lián)合暴露復(fù)合效應(yīng)的作用模式及作用機制進行研究。SD大鼠每天灌胃染毒1次，連續(xù)12d。染毒結(jié)束后處死大鼠，取血清測定血液生化指標(biāo)，取組織進行組織病理學(xué)檢查，同時檢測組織

10、脂質(zhì)過氧化和組織中細(xì)胞色素P4501A1(cytochromeP4501A1，CYP1A1)、熱休克蛋白70(heatshockprotein70，HSP70)的表達(dá)情況。結(jié)果表明，TCDD與PCBs單獨及聯(lián)合染毒均引起明顯的毒性效應(yīng)，表現(xiàn)為：動物體重明顯下降、臟器系數(shù)與血清生化指標(biāo)改變、組織病理學(xué)改變以及組織發(fā)生氧化損傷、誘導(dǎo)組織CYP1A1和HSP70蛋白高表達(dá)，且這些毒性效應(yīng)在聯(lián)合染毒組表現(xiàn)更為明顯。通過芳烴受體誘導(dǎo)組織CYP1A

11、1高表達(dá)，導(dǎo)致氧化損傷在TCDD和PCBs復(fù)合毒性效應(yīng)中可能發(fā)揮重要的作用。此外，組織中丙二醛(malondialdehyde，MDA)、超氧化物歧化酶(superoxidedismutase，SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶(glutathioneperoxide，GSH-Px)、CYP1A1和HSP70蛋白可能成為TCDD與PCBs復(fù)合毒性效應(yīng)的候選分子生物標(biāo)志物。析因方差分析結(jié)果表明，TCDD與PCBs的復(fù)合效應(yīng)很復(fù)雜，在本實驗條件下

12、，對于不同的毒性評價終點聯(lián)合作用模式表現(xiàn)不一，既有相加作用，又有協(xié)同和拮抗作用。 綜合本研究結(jié)果，在本實驗條件下，可以得到如下結(jié)論：①利用代謝組學(xué)技術(shù)可以區(qū)分不同毒性作用機制的代謝表型，代謝組學(xué)技術(shù)用于EDs復(fù)合效應(yīng)研究具有良好的應(yīng)用前景。②代謝組學(xué)分析結(jié)果與常規(guī)檢測指標(biāo)具有良好的相關(guān)性且具更多優(yōu)勢。③TCDD與PCBs單獨及聯(lián)合暴露均可引起大鼠毒性效應(yīng)，聯(lián)合暴露的復(fù)合毒性效應(yīng)更顯著。④TCDD與PCBs復(fù)合效應(yīng)的作用模式復(fù)雜