環(huán)境內(nèi)分泌干擾物的分析方法建立、環(huán)境監(jiān)測和生殖內(nèi)分泌毒理研究.pdf

1、環(huán)境內(nèi)分泌干擾物(Endocrinedisruptingchemicals，EDCs)對人類和動(dòng)物的生殖內(nèi)分泌干擾效應(yīng)引起了國內(nèi)外研究學(xué)者的廣泛關(guān)注。水生環(huán)境中痕量EDCs的監(jiān)測及其對魚類的生殖內(nèi)分泌毒理研究是各種研究領(lǐng)域的前沿工作。水生環(huán)境和生物體中EDCs和性類固醇激素的存在具相互關(guān)聯(lián)的特性。本論文的研究目的是通過建立環(huán)境水和生物樣品中痕量多組分(多種EDCs和自然類固醇激素)同時(shí)分析的測定方法入手；監(jiān)測養(yǎng)殖水體中EDCs的污染狀況

2、；闡明EDCs干擾魚類生殖內(nèi)分泌的可能途徑，并結(jié)合細(xì)胞生物學(xué)方法研究EDCs的生殖毒性。主要研究內(nèi)容如下： 1.采用固相微萃取(Solidphasemicroextraction，SPME)/硅烷化技術(shù)與氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用，建立了同時(shí)測定多種EDCs和自然類固醇激素的分析方法。目標(biāo)化合物選用三種典型EDCs：壬基酚(technicalgradenonylphenol，t-NP)、辛基酚(octylphenol，OP)和乙烯雌酚(d

3、iethylstilbestrol，DES)；及五種自然類固醇激素：脫氫異雄(甾)酮(dehydroisoandrosterone，DEHA)，雌酮(estrone，E1)，雌二醇(17β-estradiol，E2)，睪酮(testosterone，T)和孕烯醇酮(pregnenolone，PREG)。詳細(xì)優(yōu)化了影響手動(dòng)固相微萃取和硅烷化性能的各種參數(shù)，包括萃取時(shí)間和溫度、離子強(qiáng)度、pH值、衍生化時(shí)間和溫度。所建立的方法對目標(biāo)化合物的定

4、量線性范圍跨越了三個(gè)數(shù)量級，平均相關(guān)系數(shù)為0.9968。在河水和血液中目標(biāo)化合物的最低檢出限/(定量限)分別為0.002～0.378/(0.008～1.261)μg/L和0.004～0.474/(0.013～1.579)μg/L。將所建立的方法與傳統(tǒng)的固相萃取(Solidphaseextraction，SPE)技術(shù)進(jìn)行了比較。相比于SPE，SPME具較低的檢出限、樣品消耗體積少、不需要溶劑等優(yōu)點(diǎn)，是同時(shí)分析EDCs和類固醇激素的簡單快速

5、和靈敏的方法。將建立的方法應(yīng)用于實(shí)際樣品分析，在河水中t-NP、OP和DES的濃度分別為0.15、4.67和0.02μg/L，而在魚類血液中則達(dá)到1.61、1.08和4.58μg/L；類固醇激素E1、E2和T在河水中分別為0.18、0.10和5.55μg/L，在雌魚血漿中E1、E2和PREG分別為1.61、1.08和4.58μg/L。 2.基于手動(dòng)方法，建立了全自動(dòng)多組分同時(shí)分析的方法。優(yōu)化了可能影響方法性能的各種操作條件，包括

6、萃取時(shí)間、衍生化時(shí)間、離子強(qiáng)度、pH值、預(yù)置溫度、樣品體積和萃取溶劑等。大部分目標(biāo)化合物的定量線性范圍跨越了三個(gè)數(shù)量級，相關(guān)系數(shù)為0.9932～1,檢出限和定量限分別為0.001～0.124μg/L和0.004～0.413μg/L。與手動(dòng)方法相比，自動(dòng)方法縮短了樣品分析時(shí)間，耗費(fèi)人力少，分析通量和精密度有所提高。建立的全自動(dòng)方法也應(yīng)用于實(shí)際樣品中目標(biāo)化合物的檢測，其測定結(jié)果與手動(dòng)方法處于同一數(shù)量級，無顯著差異。因此，建立的全自動(dòng)SPME

7、/硅烷化/氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用在環(huán)境樣品多組分分析中顯示有良好的應(yīng)用，并比手動(dòng)方法的性能有所改善。 3.采用自動(dòng)分析方法，初步調(diào)查了珠三角冬季養(yǎng)殖水體中上述目標(biāo)化合物的污染狀況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：(1)幾乎在所有樣本中都可檢出上述三種EDCs和二種自然類固醇雌激素，同一化合物在不同樣本中的濃度均處于同一數(shù)量級，在不同地段之間無明顯區(qū)別；(2)三種EDCs的含量分別為：OP濃度介于0.06～0.85μg/L，均值為0.26μg/L；t-NP濃

8、度介于1.75～6.02μg/L，均值為3.40μg/L；DES濃度介于＜定量限～0.009μg/L，均值為0.003μg/L；(3)兩種自然雌激素含量分別為：E1濃度介于0.08～0.35μg/L，均值為0.19μg/L；E2濃度介于0.04～0.22μg/L，均值為0.10μg/L。 4.研究了性成熟雄性鯽魚(Cyprinuscarpio)重復(fù)暴露于不同濃度的t-NP(處理濃度分別為1，10和100μg/L)中的生殖內(nèi)分泌毒

9、理。以DES(處理濃度為10μg/L)為陽性對照，對水和血漿樣品中t-NP、DES和性類固醇激素的動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行了同時(shí)分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：(1)t-NP和DES處理組的原始實(shí)際濃度一般約為處理濃度的60-80％(t-NP分別為1.39、8.57和64.45μg/L，DES為6.48ug/L)，并在施加后迅速下降，在魚血漿中則檢測到高濃度的t-NP和DES，表明t-NP和DES已積累在魚體內(nèi)，魚類的吸收是t-NP和DES下降的主要原因；(2)在

10、10μg/L濃度處理下，t-NP在血漿中的生物富集因子(bioconcentrationfactor，BCF)值為20，比DES的BCF值(4.9)高約4倍，說明t-NP在體內(nèi)代謝比DES慢；(3)t-NP處理引起了顯著的劑量和時(shí)間相關(guān)的雌激素(E1和E2)濃度升高和雄激素(T)水平的降低，10μg/LDES處理引起了比100μg/Lt-NP處理更顯著的相似情況的激素水平變化。說明t-NP和DES具相似的作用機(jī)制，都是通過雌雄激素比例的

11、改變引起雌激素效應(yīng)，且DES的雌激素效應(yīng)遠(yuǎn)比t-NP強(qiáng)；4)在10μg/LDES處理21天后，雌激素和雄激素濃度均比14天時(shí)稍有下降?？赡苁囚~體積累了一定閾值濃度的EDCs后，產(chǎn)生了不同于雌激素效應(yīng)的毒性效應(yīng)。 5.以EDCs處理21天的性成熟雄性鯽魚為研究對象，通過光學(xué)顯微和透射電子顯微方法，對其精巢和肝臟的組織病理損傷進(jìn)行了研究。結(jié)果表明：(1)t-NP對肝臟和精巢的結(jié)構(gòu)病變具劑量效應(yīng)，且10μg/LDES處理能引起比100

12、μg/Lt-NP處理更顯著的相似的組織病變現(xiàn)象，表明t-NP和DES具同樣的作用機(jī)制，且DES的雌激素效應(yīng)遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于t-NP，這與激素變化的結(jié)論一致；(2)100μg/Lt-NP和10μg/LDES處理導(dǎo)致精巢的精小囊結(jié)構(gòu)退化，精子細(xì)胞發(fā)育異常，與該濃度處理下引起的雄激素水平降低有關(guān)。此外，支持細(xì)胞數(shù)目增多，與退化的生殖細(xì)胞有關(guān)；間質(zhì)細(xì)胞肥大，與激素生成狀態(tài)改變有關(guān)；(3)100μg/Lt-NP和10μg/LDES處理引起肝細(xì)胞滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)