熒光法測(cè)定果蔬及飲料中的抗壞血酸

1、1新編實(shí)驗(yàn)新編實(shí)驗(yàn)熒光法測(cè)定果蔬及飲料中的抗壞血酸熒光法測(cè)定果蔬及飲料中的抗壞血酸實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆辗肿訜晒夥治龇ǖ幕驹?；了解Rf530熒光儀的使用方法；熟悉熒光法測(cè)定果蔬及飲料中的抗壞血酸含量的方法。實(shí)驗(yàn)原理維生素C又名抗壞血酸，自然界存在的有L型、D型兩種，D型的生物活性僅為L(zhǎng)型的110。維生素C廣泛存在于植物組織中，新鮮的水果、蔬菜中含量都很豐富。維生素C具有較強(qiáng)的還原性，對(duì)光敏感，氧化后的產(chǎn)物稱為脫氫抗壞血酸，仍然具有生理活性，進(jìn)

2、一步水解則生成23二酮古樂糖酸，失去生理作用。食品分析中的所謂總抗壞血酸是指抗壞血酸和脫氫抗壞血酸二者的總量，不包括二酮古樂糖酸和進(jìn)一步的氧化產(chǎn)物。測(cè)定維生素C的常用方法有靛酚滴定法、苯肼比色法、熒光法和高效液相色譜法等。靛酚滴定法測(cè)定的是還原型抗壞血酸，該法簡(jiǎn)便，也較靈敏，但特異性差，樣品中的其它還原性物質(zhì)（如Fe2、Sn2、Cu等）會(huì)干擾測(cè)定，測(cè)定結(jié)果往往偏高。苯肼比色法和熒光比色法測(cè)得的都是抗壞血酸和脫氫抗壞血酸的總量，其中以熒光

3、法受干擾的影響較小，準(zhǔn)確度較高。高效液相色譜法可以同時(shí)測(cè)得抗壞血酸和脫氫抗壞血酸的含量，選擇性好、準(zhǔn)確度高、重現(xiàn)性好，但對(duì)樣品前處理要求高。本實(shí)驗(yàn)采用的是熒光分析法，其原理是通過將樣品中還原型抗壞血酸經(jīng)銅離子催化被氧化生成脫氫型抗壞血酸后，與鄰苯二胺（OPDA）反應(yīng)生成具有熒光的喹唔啉，依據(jù)熒光強(qiáng)度與脫氫抗壞血酸的濃度在一定條件下成正比，測(cè)定食物中抗壞血酸的總量。試劑及儀器Rf530熒光分光光度計(jì)，硫酸銅溶液（2.0mgml），鄰苯二胺

4、（0.3mgml），抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)溶液（25.0mgL），乙酸乙酸鈉硫酸緩沖液（pH5.6）。實(shí)驗(yàn)內(nèi)容（1）樣品處理稱取一定質(zhì)量的果蔬（25g左右），加入一定質(zhì)量的蒸餾水（25g左右），打成勻漿后過濾，取5.0ml濾液至50ml容量瓶中，定容，放入冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆?。液體樣品不需要處理，或稀釋一定倍數(shù)后備用。（2）標(biāo)準(zhǔn)溶液及樣品溶液的配制標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：取6個(gè)10ml比色管（編號(hào)16），分別加入0.0、0.2、0.5、1.0、1.5、2.0m

5、l抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，再依次分別加入2.0ml緩沖液，0.40ml硫酸銅溶液和2.0mlOPDA溶液，定容至10ml。20min后可進(jìn)行熒光測(cè)定。樣品溶液的配制：取1個(gè)10ml比色管（編號(hào)71），加入1.0ml待測(cè)樣品溶液，再依次加入2.0ml緩沖液，0.40ml硫酸銅溶液和2.0mlOPDA溶液，定容至10ml。20min后可進(jìn)行熒2光測(cè)定。（3）熒光激發(fā)和發(fā)射光譜測(cè)定取6號(hào)溶液于熒光比色皿中，在熒光儀上分別掃描其熒光激發(fā)光譜及發(fā)射光譜

6、：首先以351nm為激發(fā)波長(zhǎng)，掃描發(fā)射光譜，確定最大發(fā)射波長(zhǎng)；然后以選定的最大發(fā)射波長(zhǎng)掃描激發(fā)光譜，確定最大激發(fā)光波長(zhǎng)；最后再以選定的激發(fā)波長(zhǎng)掃描發(fā)射光譜。記錄最大激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)。（4）標(biāo)樣及樣品檢測(cè)以選定的最大激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)，依次測(cè)定16號(hào)標(biāo)樣的熒光強(qiáng)度；在相同條件下，測(cè)定的7號(hào)樣品的熒光強(qiáng)度。結(jié)果處理標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：根據(jù)16號(hào)標(biāo)樣的熒光強(qiáng)度，以熒光強(qiáng)度對(duì)濃度作圖，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)7號(hào)樣品的熒光強(qiáng)度，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣品溶液中抗壞血

7、酸的含量；再根據(jù)樣品處理及溶液配制過程中的稀釋關(guān)系計(jì)算原始樣品中抗壞血酸的含量。注意事項(xiàng)（1）本實(shí)驗(yàn)全部過程應(yīng)盡量避光。（2）鄰苯二胺溶液在空氣中顏色會(huì)逐漸變深，影響熒光衍生反應(yīng)，故應(yīng)用棕色瓶配制，在冰箱中保存不超過3天。（3）不同的樣品中抗壞血酸的含量不相同，稱取的樣品量可酌量增減。思考題1、寫出熒光生成反應(yīng)式，并根據(jù)熒光與分子結(jié)構(gòu)解釋熒光的產(chǎn)生。2、如何測(cè)定某物質(zhì)的熒光激發(fā)光譜與發(fā)射光譜曲線？3、熒光光譜中可能出現(xiàn)多個(gè)峰，如何判斷是