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1、專題專題1基因工程基因工程基因工程的概念基因工程是指按照人們的愿望,進(jìn)行嚴(yán)格的設(shè)計(jì),通過體外體外DNADNA重組和轉(zhuǎn)基因技術(shù)重組和轉(zhuǎn)基因技術(shù),賦予生物以新的遺傳特性新的遺傳特性,創(chuàng)造出更符合人們需要的新的生物類型和生物產(chǎn)品更符合人們需要的新的生物類型和生物產(chǎn)品?;蚬こ淌窃贒NADNA分子水平分子水平上進(jìn)行設(shè)計(jì)和施工的,又叫做DNADNA重組技術(shù)重組技術(shù)。(一)基因工程的基本工具1.“分子手術(shù)刀”——限制性核酸內(nèi)切酶(限制酶)限制性核酸
2、內(nèi)切酶(限制酶)(1)來源:主要是從原核生物原核生物中分離純化出來的。(2)功能:能夠識(shí)別雙鏈DNA分子的某種特定特定的核苷酸序列,并且使每一條鏈中特定特定部位的兩個(gè)核苷酸之間的磷酸二酯鍵磷酸二酯鍵斷開,因此具有專一專一性。(3)結(jié)果:經(jīng)限制酶切割產(chǎn)生的DNA片段末端通常有兩種形式:黏性末端黏性末端和平末端平末端。2.“分子縫合針”——DNADNA連接酶連接酶(1)兩種DNA連接酶(EcoliDNA連接酶和T4DNA連接酶)的比較:①相
3、同點(diǎn):都縫合磷酸二酯磷酸二酯鍵。②區(qū)別:EcoliDNA連接酶來源于T4噬菌體噬菌體,只能將雙鏈DNA片段互補(bǔ)的黏性末端黏性末端之間的磷酸二酯鍵連接起來;而T4DNA連接酶能縫合兩種末端兩種末端,但連接平末端的之間的效率較低。(2)與DNA聚合酶作用的異同:DNA聚合酶只能將單個(gè)核苷酸單個(gè)核苷酸加到已有的核苷酸片段的末端,形成磷酸二酯鍵。DNA連接酶是連接兩個(gè)兩個(gè)DNADNA片段片段的末端,形成磷酸二酯鍵。3.“分子運(yùn)輸車”——載體載體
4、(1)載體具備的條件:①能在受體細(xì)胞中復(fù)制并穩(wěn)定保存能在受體細(xì)胞中復(fù)制并穩(wěn)定保存。②具有一至多個(gè)限制酶切點(diǎn),供外源具有一至多個(gè)限制酶切點(diǎn),供外源DNADNA片段插入片段插入。③具有標(biāo)記基因,供重組具有標(biāo)記基因,供重組DNADNA的鑒定和選擇的鑒定和選擇。(2)最常用的載體是質(zhì)粒質(zhì)粒它是一種裸露的、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單的、獨(dú)立于裸露的、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單的、獨(dú)立于細(xì)菌染色體之外細(xì)菌染色體之外,并具,并具有自我復(fù)制能力自我復(fù)制能力的雙鏈的雙鏈環(huán)狀環(huán)狀DNADNA
5、分子分子。(3)其它載體:噬菌體的衍生物、動(dòng)植物病毒噬菌體的衍生物、動(dòng)植物病毒(二)基因工程的基本操作程序第一步:目的基因的獲取目的基因的獲取1.目的基因是指:編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因。2.原核基因采取直接分離直接分離獲得,真核基因是人工合成人工合成。人工合成目的基因的常用方法有反轉(zhuǎn)錄法轉(zhuǎn)錄法_和化學(xué)合成法化學(xué)合成法_。3.PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因(1)原理:DNADNA雙鏈復(fù)制雙鏈復(fù)制(2)過程:第一步:加熱至90~95
6、℃DNADNA解鏈解鏈;第二步:冷卻到55~60℃,引物結(jié)合到引物結(jié)合到互補(bǔ)互補(bǔ)DNADNA鏈;第三步:加熱至70~75℃,熱穩(wěn)定熱穩(wěn)定DNADNA聚合酶從引物起始互補(bǔ)鏈的合成聚合酶從引物起始互補(bǔ)鏈的合成。第二步:基因表達(dá)載體的構(gòu)建基因表達(dá)載體的構(gòu)建1.目的:使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在穩(wěn)定存在,并且可以遺傳至下一代遺傳至下一代,使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用達(dá)和發(fā)揮作用。2.組成:目的基因目的基因+啟動(dòng)子啟動(dòng)子+終止子終止子+標(biāo)記基因
7、標(biāo)記基因(1)啟動(dòng)子:是一段有特殊結(jié)構(gòu)的DNADNA片段片段,位于基因的首端首端,是RNARNA聚合酶聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位,能驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出轉(zhuǎn)錄出mRNAmRNA,最終獲得所需的蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)。(2)終止子:也是一段有特殊結(jié)構(gòu)的DNADNA片段片段,位于基因的尾端尾端。(3)標(biāo)記基因的作用:是為了鑒定受體細(xì)胞中是否含有目的基因是否含有目的基因,從而將含有目的基因的含有目的基因的細(xì)胞細(xì)胞篩選出來。常用的標(biāo)記基因是抗生素基因抗生素基因。第三
8、步:將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞_專題專題2細(xì)胞工程細(xì)胞工程(一)植物細(xì)胞工程1.理論基礎(chǔ)(原理):細(xì)胞全能性細(xì)胞全能性全能性表達(dá)的難易程度:受精卵>生殖細(xì)胞>干細(xì)胞>體細(xì)胞受精卵>生殖細(xì)胞>干細(xì)胞>體細(xì)胞;植物細(xì)胞>動(dòng)物細(xì)胞植物細(xì)胞>動(dòng)物細(xì)胞2.植物組織培養(yǎng)技術(shù)(1)過程:離體離體的植物器官、組織或細(xì)胞―→愈傷組織愈傷組織―→試管苗―→植物體(2)用途:微型繁殖、作物脫毒、制造人工種子、單倍體育種、細(xì)胞產(chǎn)物的工廠化生產(chǎn)
9、微型繁殖、作物脫毒、制造人工種子、單倍體育種、細(xì)胞產(chǎn)物的工廠化生產(chǎn)。A植物繁殖微型繁殖:可以高效快速地實(shí)現(xiàn)種苗的大量繁殖作物脫毒:采用莖尖莖尖組織培養(yǎng)來除去病毒(因?yàn)橹参锓稚鷧^(qū)附近的病毒極少或沒有植物分生區(qū)附近的病毒極少或沒有)人工種子:以植物組織培養(yǎng)得到的胚狀體、不定芽、頂芽和腋芽等為材料,經(jīng)人工薄膜包裝得到的種子。優(yōu)點(diǎn):完全保持優(yōu)良品種的遺傳特性,不受季節(jié)的限制;方便儲(chǔ)藏和運(yùn)輸優(yōu)點(diǎn):完全保持優(yōu)良品種的遺傳特性,不受季節(jié)的限制;方便儲(chǔ)
10、藏和運(yùn)輸B作物新品種培育單倍體育種:a過程:植株(AaBb)通過減數(shù)分裂得到花粉(AB、Ab、aB、ab四種類型);對(duì)花粉進(jìn)行花藥離體培養(yǎng)(技術(shù)是植物組織培養(yǎng))藥離體培養(yǎng)(技術(shù)是植物組織培養(yǎng));得到單倍體植株單倍體植株;對(duì)其幼苗時(shí)期進(jìn)行秋水仙素水仙素處理;得到了正常的純合二倍體植株(AABB、AAbb、aaBB、aabb四種類型)。b優(yōu)點(diǎn):明顯縮短育種年限C突變體利用:在組織培養(yǎng)中會(huì)出現(xiàn)突變體,通過從有用的突變體中選育出新品種(如篩選抗
11、病、抗鹽、含高蛋白的突變體選抗病、抗鹽、含高蛋白的突變體)D細(xì)胞產(chǎn)物的生產(chǎn):通過能夠產(chǎn)生對(duì)人們有利的產(chǎn)物的細(xì)胞進(jìn)行組織培養(yǎng),從而讓它們能夠產(chǎn)生大量的細(xì)胞產(chǎn)物。(3)地位:是培育轉(zhuǎn)基因植物轉(zhuǎn)基因植物、植物體細(xì)胞雜交植物體細(xì)胞雜交培育植物新品種的最后一道工序。3.植物體細(xì)胞雜交技術(shù)(1)過程:(2)誘導(dǎo)融合的方法:物理法包括離心、振動(dòng)、電刺激離心、振動(dòng)、電刺激等?;瘜W(xué)法一般是用聚乙二醇(聚乙二醇(PEGPEG)作為誘導(dǎo)劑。(3)意義:克服了
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