肺結(jié)核診斷新技術(shù)

1、結(jié)核病診斷新技術(shù)及其評(píng)價(jià),寶雞市人民醫(yī)院呼吸科 魏勝全,內(nèi)容,,二、生化檢測(cè),三、細(xì)胞免疫學(xué)檢測(cè),一、微生物學(xué)檢測(cè),四、分子生物學(xué)檢測(cè),呼吸醫(yī)生的尷尬？,先抗炎？？？再抗癆？？？實(shí)在不行，上化療？？？？,你懂的！TB 的診斷有時(shí)有多難！病原學(xué)檢測(cè)是診斷 TB 最重要的依據(jù)，但據(jù) 2013 年 WHO 統(tǒng)計(jì)，僅有 58% 的 TB 患者

2、有病原學(xué)依據(jù)。,前言,早期準(zhǔn)確診斷是結(jié)核病 (TB) 患者得以及時(shí)治療的關(guān)鍵。目前的 TB 診斷水平仍然薄弱。據(jù)世界衛(wèi)生組織 (WHO) 估算， 2012 年的 860 萬(wàn)新發(fā) TB 患者中，僅登記了 570 萬(wàn)，還有 217.5 萬(wàn) (25.3%) 未被發(fā)現(xiàn) (漏診)。提高診斷技術(shù)則是發(fā)現(xiàn)患者，減少誤診、漏診的核心。,2024/3/28,一 、微生物學(xué)檢測(cè),包括涂片染色鏡檢、結(jié)核分枝桿菌 (MTB) 分離培養(yǎng)、 MTB 藥敏和

3、菌種鑒定等。染色涂片法是臨床上最便捷快速的診斷方法，但敏感度偏低，發(fā)達(dá)國(guó)家可檢出 50% 的活動(dòng)性肺結(jié)核，我國(guó)檢出率一般約為 30%， 且無(wú)法區(qū)別非 MTB( Mycobacterium tuberculosis )。 MTB 分離培養(yǎng)是確診 TB 最重要的依據(jù)，不僅能取得病原學(xué)結(jié)果，還能進(jìn)一步進(jìn)行藥敏檢測(cè)，指導(dǎo)治療。目前常用的細(xì)菌培養(yǎng)基包括 Lowenstein-Jensen 固相培養(yǎng)基 (L-J 法) 和 M

4、iddlebrook 7H9 7H11 液體培養(yǎng)基。固相培養(yǎng)基價(jià)格低，但耗時(shí)長(zhǎng)，需要 4~8 周取得結(jié)果，加上菌種鑒定的時(shí)間耗時(shí)更長(zhǎng)?；?BACTEC MGIT 960、 BacT/Alert 3D 系統(tǒng)的液體培養(yǎng)基檢測(cè)速度有明顯提高 (1~4 周)， 但費(fèi)用較高。,一 、微生物學(xué)檢測(cè),1.1 MTB 快速培養(yǎng)法BACTEC MGIT 960 系統(tǒng)采用熒光增強(qiáng)原理，在培養(yǎng)管底部包埋對(duì)氧氣濃度高度敏感的指示劑，通過(guò)檢測(cè)氧氣濃度變化以監(jiān)

5、測(cè)培養(yǎng)管內(nèi) MTB 的生長(zhǎng)狀態(tài)。陽(yáng)性標(biāo)本檢出時(shí)間相對(duì)較短，平均為 9 d， 后續(xù)菌種鑒定及藥敏試驗(yàn)時(shí)間平均為 4 d。 BACTEC MGIT 960 系統(tǒng)為目前國(guó)際通行培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)，培養(yǎng)陽(yáng)性率較固體培養(yǎng)法高出 10% 左右，檢測(cè)界限 <10 個(gè)菌落形成單位 (CFU)/mL。 BacT/Alert 3D 系統(tǒng)采用比色法原理，通過(guò)監(jiān)測(cè)預(yù)處理標(biāo)本中產(chǎn)生 CO2 與標(biāo)本瓶中初始的 CO2 相比較，判斷是否存在 MTB 生長(zhǎng)。同時(shí)可以進(jìn)行藥

6、敏檢測(cè)。理論上培養(yǎng)速度較 L-J 法和 BACTEC MGIT 960 系統(tǒng)更快 (6~22 d)。1.2 直接顯微鏡檢技術(shù) (MODS)工作原理依據(jù)于 MTB 在液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)會(huì)出現(xiàn)特征性的索狀結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)可以通過(guò)倒置顯微鏡觀察到。 檢測(cè)呼吸道標(biāo)本中是否存在 MTB 的敏感度為 97.5%， 特異度為 94.4%， 出現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果的中位時(shí)間約為 8 d 該方法無(wú)需昂貴的設(shè)備，簡(jiǎn)單，相對(duì)快速。,二、生化檢測(cè),TB 的生化檢測(cè)主要包

7、括腺苷脫氨酶 (ADA)、 乳酸脫氫酶 (LDH)、 血管緊張素轉(zhuǎn)化酶 (ACE) 等酶學(xué)檢測(cè)。此類方法簡(jiǎn)單快速，適用于 TB 早期診斷及鑒別診斷，但由于缺少結(jié)核特異性的酶標(biāo)而無(wú)確診價(jià)值。2.1 ADAADA 是嘌呤核苷代謝中重要的酶。胸 (腹) 腔積液 ADA 檢測(cè)對(duì)結(jié)核性胸 (腹) 膜炎鑒別診斷有重要意義，胸 (腹) 腔積液 ADA 濃度以 45U/L 為界，結(jié)核性大多超過(guò)此值，特異度及敏感度超過(guò) 80%。 胸 (腹) 腔積液

8、 ADA 與血清 ADA 比值 ≥1 更傾向結(jié)核性積液。而對(duì)于癌性及非特異性積液，其比值一般 8U/L，而后兩者一般正常， ADA 濃度 ≤8U/L。 結(jié)核性腦膜炎 表明，將 ADA 濃度 >8U/L 作為結(jié)核性腦膜炎診斷的閾值時(shí)，其診斷的總敏感度 96%。,二、生化檢測(cè),2.2 LDH是一種糖酵解酶，幾乎存在于機(jī)體所有組織細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)。對(duì) TB 的診斷來(lái)說(shuō)， LDH 可用于區(qū)別滲出性積液與漏出性積液，胸 (腹) 腔積液 LDH

9、 與血清 LDH 比值 ≥0.6， LDH 濃度 >200U/L 傾向滲出液。結(jié)核性胸 (腹) 腔積液的 LDH 濃度一般 >200U/L， 與癌性胸 (腹) 腔積液 LDH 濃度變化無(wú)特征性差異。2.3 ACE為二肽羧肽水解酶，又名激肽酶 I， 存在于肺、腎、腦、小腸、胎盤(pán)等組織的血管內(nèi)皮細(xì)胞或上皮細(xì)胞及血漿。對(duì) TB 的診斷來(lái)說(shuō)，血清 ACE 的檢測(cè)主要用于 TB 與結(jié)節(jié)病的鑒別，后者血清 ACE 濃度升高多見(jiàn)。

10、結(jié)核性胸腔積液 ACE 濃度一般不升高，胸腔積液 ACE 與血清 ACE 比值 ≥1 更傾向結(jié)核性積液，而惡性積液的比值多 <1。,三、細(xì)胞免疫學(xué)檢測(cè),MTB 為胞內(nèi)致病菌，因此普遍認(rèn)為 TB 的發(fā)病過(guò)程中細(xì)胞免疫占主導(dǎo)地位。細(xì)胞免疫學(xué)診斷主要包括結(jié)核菌素皮膚試驗(yàn) (tuberculin skin test， TST) 和 γ- 干擾素釋放試驗(yàn) (interferon gamma releaseassay， IGRA)， 而結(jié)合上

11、述兩種方法優(yōu)點(diǎn)的改良結(jié)核菌素皮膚試驗(yàn)近年來(lái)發(fā)展很快。3.1 TST即 PPD 皮試或皮內(nèi) Mantoux 試驗(yàn)。 TST 從 1890 年發(fā)明以來(lái)沿用至今。由于 TST 存在假陽(yáng)性結(jié)果和假陽(yáng)性結(jié)果，影響了其使用價(jià)值。假陽(yáng)性結(jié)果大部分是由于結(jié)核菌素抗原與其他分枝桿菌有交叉抗原所致。這種交叉抗原反應(yīng)來(lái)自潛在的非 MTB 感染或接種卡介苗引起的反應(yīng)。假陰性結(jié)果有很多潛在的原因，遲發(fā)超敏反應(yīng)低下常見(jiàn)于免疫受損者，包括人免疫缺陷病毒 (HI

12、V) 感染，長(zhǎng)期使用激素等情況。陰性結(jié)果不能排除 MTB 感染。由于不同地區(qū)的感染背景差異較大以及沒(méi)有潛伏性結(jié)核感染 (LTBI) 的檢測(cè)金標(biāo)準(zhǔn)，導(dǎo)致 TST 的敏感度和特異度不能準(zhǔn)確評(píng)價(jià)。,三、細(xì)胞免疫學(xué)檢測(cè),3.2 血清學(xué)檢測(cè)WHO 和不少國(guó)家推薦使用 IGRA( interferon gamma release assay) 進(jìn)行 MTB 感染的血清學(xué)檢測(cè)，這類試驗(yàn)采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) (ELISA) 和 (或)

13、酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)法 (ELISPOT) 定量檢測(cè)全血和 (或) 外周血單核細(xì)胞在 MTB 特異性抗原刺激下釋放 γ- 干擾素的水平，用于診斷 LTBI 及輔助診斷 TB。 目前利用 IGRA 原理，有 2 種較為成熟的試劑盒，即 QuantiFERONTB GOLD In Tube 試劑盒 (QFT-GIT， Cellestis Incorporated， Carnegie， Australia) 和 T-SPOT. TB 試劑盒 (O

14、xford Immunotec， Abingdon，UK)， 先后被美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局 (FDA) 批準(zhǔn)應(yīng)用于臨床。檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性可被判斷為 MTB 感染。 IGRA 在 24h之內(nèi)就可以獲得結(jié)果，花費(fèi)的時(shí)間比 TST 短，并且不會(huì)因?yàn)閺?fù)強(qiáng)效應(yīng) (Booster 效應(yīng)) 受到影響，可反復(fù)進(jìn)行，在有試驗(yàn)條件的醫(yī)院里，該試驗(yàn)的操作和管理比 TST 更便捷，不需要專門(mén)的醫(yī)生多次觀察結(jié)果。同 TST 一樣，這種方法無(wú)法區(qū)分 LTBI 與活動(dòng)性

15、肺結(jié)核，因此，不能單獨(dú)作為 TB 的確診依據(jù)。,三、細(xì)胞免疫學(xué)檢測(cè),,Nil (不與抗原共孵育的血漿中γ干擾素的濃度 [ 陰性對(duì)照組])；TB antigen minus nil (與 3 種結(jié)核特異性抗原共孵育后血漿中Y- 干擾素的濃度減去陰性組的值)；mitogen minus nil ( 與有絲分裂原抗原共孵育后血漿中 Y- 干擾素的濃度減去陰性組的值；有絲分裂原管包含植物血凝素，能非特異性激活 T 細(xì)胞，作為陽(yáng)性對(duì)照用以保證

16、細(xì)胞對(duì)抗原的反應(yīng)能力和校正血樣的處理和孵。B 對(duì)于這種 IGRA，1 mL 血抽入到 3 根管中（陰性對(duì)照，陽(yáng)性對(duì)照和 TB 抗原管）。計(jì)算 TB 抗原管中全血刺激產(chǎn)生的γ干擾素和陰性對(duì)照管中的γ干擾素的差值作為 TB 反應(yīng)。陽(yáng)性結(jié)果需滿足以下標(biāo)準(zhǔn)。(1) 陰性對(duì)照小于 8 IU/mL；(2) TB 抗原管減去陰性對(duì)照管結(jié)果≥0.35 IU/mL，且≥25% 陰性對(duì)照管結(jié)果；(3) 陽(yáng)性對(duì)照管有反應(yīng)。,細(xì)胞免疫學(xué)檢測(cè),目前IGRA檢

17、測(cè)成本偏高，不適用于人群篩查。試驗(yàn)結(jié)果在一定程度上受到T 細(xì)胞水平及活性的影響，對(duì)于免疫抑制或者免疫缺陷者可能會(huì)結(jié)果不準(zhǔn)確。雖然有資料表明對(duì)于 HIV 感染、血液病、惡性腫瘤、矽肺以及慢性腎衰者，預(yù)防性治療 TB 潛伏感染的常用方法是 IGRA， 但對(duì)于其中嚴(yán)重的免疫抑制者， IGRA 的診斷價(jià)值會(huì)降低。對(duì)于中國(guó)人群來(lái)說(shuō)， IGRA 并不能顯示出明顯超過(guò) TST 的優(yōu)勢(shì)。MTB 核酸擴(kuò)增檢測(cè) (NAA) :是近年來(lái) TB 診斷領(lǐng)域

18、中最有突破的，檢測(cè)手段日趨成熟。部分新型的核酸檢測(cè)技術(shù) (如分子線性探針檢測(cè)) 得到了 WHO 的認(rèn)可和推薦，可用于 TB 的診斷和耐藥檢測(cè)。理論上 NAA 敏感性很好，即使標(biāo)本中只有極低拷貝數(shù)的細(xì)菌也能檢出，一般 24h 之內(nèi)即可取得檢驗(yàn)結(jié)果，并且在生物安全級(jí)別上要求相對(duì)較低，還可以通過(guò)檢測(cè)異煙肼和利福平的常見(jiàn)耐藥基因位點(diǎn)，從而篩查出耐藥 MTB。,三、分子生物學(xué)檢測(cè),4.1 標(biāo)準(zhǔn)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) (PCR)是體外酶促合成特異 DNA

19、 片段的一種方法，由高溫變性、低溫退火 (復(fù)性) 及適溫延伸等幾步反應(yīng)組成 1 個(gè)周期，循環(huán)進(jìn)行，使目的 DNA 得以迅速擴(kuò)增，具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、操作簡(jiǎn)便、省時(shí)等特點(diǎn)。它不僅可以通過(guò)核酸擴(kuò)增檢測(cè) MTB 的存在，同時(shí)可以對(duì)特定基因位點(diǎn)檢測(cè)來(lái)判斷菌株的耐藥性。理論上 PCR 對(duì)于存在細(xì)菌的標(biāo)本都有較好的檢出率，但實(shí)際臨床上應(yīng)用可能存在一定的偏差。假陽(yáng)性結(jié)果主要由靶序列或擴(kuò)增產(chǎn)物的交叉污染所致，假陰性結(jié)果的出現(xiàn)主要是影響 Ta

20、q 酶活性，包括以下 2 個(gè)方面：一是臨床標(biāo)本中可能存在內(nèi)源性抑制因子 (5%~20%)， 如 DNA 樣品中的蛋白質(zhì)和重金屬離子；二是標(biāo)本溶血、血紅蛋白殘留、處理過(guò)程中使用苯酚等物質(zhì)。,三、細(xì)胞免疫學(xué)檢測(cè),4.2 改進(jìn)的核酸檢測(cè)技術(shù)傳統(tǒng) PCR 檢測(cè)總的敏感性尚不理想，同時(shí)可能存在污染、操作失當(dāng)?shù)纫蛩氐挠绊?，因此隨后產(chǎn)生了多種改進(jìn)手段，包括整合的 MTB 核酸擴(kuò)增檢測(cè)試劑盒以及全自動(dòng)化 MTB 檢測(cè)系統(tǒng)。前者包括如 GenP

21、robe MTB 核酸直接擴(kuò)增檢測(cè) (GenProbe amplified MTB direct test， AMTD； San Diego， CA， USA)、 羅氏 AmplicorMTB 檢測(cè) (Roche amplicor MTB test， Basel， Switzerland)、 BD-ProbeTec SDAtest (Becton Dickinson， MD， USA)， 實(shí)時(shí)熒光核酸恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)技術(shù) (simultan

22、eous amplification and testing， SAT； 仁度生物，中國(guó)) 等商業(yè)試劑盒；后者主要指 GeneXpert MTB/RIF 系統(tǒng) (Cepheid， USA)。,分子生物學(xué)檢測(cè),其中由于 WHO 的推薦， GeneXpert MTB/RIF 已在全球 60 多個(gè)國(guó)家使用，下文分別予以介紹。4.2.1 GenProbe MTB 核酸直接擴(kuò)增檢測(cè) 恒溫?cái)U(kuò)增 16S rRNA， 以 MTB 復(fù)合群特異性探針檢

23、測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，采用轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增技術(shù)對(duì)靶核酸進(jìn)行擴(kuò)增，采用化學(xué)發(fā)光物啞啶酯標(biāo)記的 DNA 探針與擴(kuò)增的靶基因進(jìn)行雜交，探針與擴(kuò)增產(chǎn)物交叉后利用雜交保護(hù)試驗(yàn)去除未雜交的標(biāo)記探針，最后利用化學(xué)發(fā)光儀檢測(cè)發(fā)光信號(hào)，可在 2h 內(nèi)做出診斷。據(jù)報(bào)道，該方法的特異度 >95%， 對(duì)痰細(xì)菌培養(yǎng)陽(yáng)性肺結(jié)核敏感度為 92%~100%， 對(duì)于痰細(xì)菌培養(yǎng)陰性肺結(jié)核敏感度為 40%~93%， 對(duì)于肺外結(jié)核敏感度約為 93%。4.2.2 羅氏 Ampl

24、icor MTB 檢測(cè) 擴(kuò)增引物 16S rRNA 基因片段，然后于各種分枝桿菌菌種特異性的寡核苷酸探針進(jìn)行反向斑點(diǎn)雜交或微孔板反向雜交鑒定菌群，部分研究表明，該方法總的特異度 >95%， 對(duì)于痰細(xì)菌培養(yǎng)陽(yáng)性肺結(jié)核檢出 >97%， 對(duì)痰細(xì)菌培養(yǎng)陰性肺結(jié)核敏感度為 40%~73% ，對(duì)肺外結(jié)核敏感度為 77%~98%。,分子生物學(xué)檢測(cè),4.2.3 BD-ProbeTec SDA test 半定量的鏈置換擴(kuò)增技術(shù)，以 IS611

25、0 和 16S rRNA 為靶序列，經(jīng)加熱變性后與特異性引物雜交，在 DNA 聚合酶的作用下產(chǎn)生帶限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)的靶 DNA 序列，然后核酸內(nèi)切酶在其識(shí)別位點(diǎn)將 DNA 雙鏈打開(kāi)缺口， DNA 聚合酶繼之延伸缺口 3’端并替換下一條 DNA 鏈。被替換下來(lái)的 DNA 單鏈可以與引物結(jié)合并被 DNA 聚合酶延伸成雙鏈。該過(guò)程不斷反復(fù)，使靶序列高效擴(kuò)增。該方法總的特異性 >90%， 對(duì)于痰細(xì)菌培養(yǎng)陽(yáng)性肺結(jié)核檢出達(dá) 90%~1

26、00%， 對(duì)于痰細(xì)菌培養(yǎng)陰性肺結(jié)核敏感度 33%~100%， 對(duì)于肺外結(jié)核敏感度為76%。4.2.4 實(shí)時(shí)熒光核酸恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)技術(shù) 在同一溫度下，首先通過(guò) M-MLV 反轉(zhuǎn)錄酶產(chǎn)生靶標(biāo)核酸的 1 個(gè)雙鏈 DNA 拷貝，然后利用 T7 RNA 多聚酶從該 DNA 拷貝上產(chǎn)生多個(gè) (100~1000) RNA 拷貝；每個(gè) RNA 拷貝再?gòu)姆崔D(zhuǎn)錄開(kāi)始進(jìn)入下一個(gè)擴(kuò)增循環(huán)；同時(shí)，帶有熒光標(biāo)記的探針和這些 RNA 拷貝特異結(jié)合，產(chǎn)生熒光。該熒

27、光信號(hào)可由熒光檢測(cè)儀器實(shí)時(shí)捕獲，直觀反映擴(kuò)增循環(huán)情況。實(shí)時(shí)熒光核酸恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)技術(shù) 試劑盒通過(guò)檢測(cè) RNA 來(lái)證實(shí) MTB 的存在，擴(kuò)增效率極高， 15~30 min 即可將模板擴(kuò)增 109 倍，理論上檢測(cè)靈敏度和準(zhǔn)確性遠(yuǎn)高于其他核酸檢測(cè)技術(shù)；該技術(shù)采用實(shí)時(shí)熒光閉管檢測(cè)，使污染得到有效控制；即使污染產(chǎn)生，由于擴(kuò)增產(chǎn)物為 RNA， 環(huán)境中極易降解，從而大幅度提高檢測(cè)結(jié)果的可靠性。目前該試劑盒已獲批準(zhǔn)于我國(guó)應(yīng)用。,,PCR原理,分子生物

28、學(xué)檢測(cè),4.2.5 GeneXpert MTB/RIF 系統(tǒng) GeneXpert MTB/RIF 檢測(cè)試劑盒為美國(guó) Cepheid 公司開(kāi)發(fā)的，適用于 GeneXpert 儀器，可在 2 h 內(nèi)直接從患者新鮮痰液或凍存痰液中檢測(cè)是否還有 MTB 及對(duì)利福平的耐藥情況，整個(gè)過(guò)程都在一密閉環(huán)境中進(jìn)行，該方法采用全自動(dòng)實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 原理，將樣品處理、核酸擴(kuò)增、目標(biāo)序列的實(shí)時(shí)檢測(cè)整合于一體，通過(guò)對(duì) MTB特有的序列 rpoB 基因上于利

29、福平耐藥相關(guān) 81bp 的核心區(qū)域 (RRDR) 進(jìn)行檢查。Boehme 等在 《新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志》 發(fā)表報(bào)道，對(duì) 4 個(gè) TB 高負(fù)擔(dān)國(guó)家的 1730 例疑似 TB 患者進(jìn)行診斷評(píng)估，對(duì)于細(xì)菌培養(yǎng)陽(yáng)性、涂片陽(yáng)性的標(biāo)本檢測(cè)時(shí)， MTB/RIF 的檢出率為 98.2% (551/561) ； 對(duì)于培養(yǎng)陽(yáng)性、涂片陰性的標(biāo)本檢測(cè)時(shí)， MTB/RIF 的一次檢出率為 72.5% (124/172)， 該檢測(cè)方法特異度達(dá) 99.2% (604

30、/694)。 與藥敏實(shí)驗(yàn)相比， MTB/RIF 檢測(cè)方法對(duì)利福平耐藥患者的檢出率高達(dá) 97.6% (200/205)， 對(duì)利福平敏感患者的檢出率達(dá) 98.1% (504/514)。 Boehme 等對(duì)南非、秘魯、印度、阿塞拜疆、菲律賓和烏干達(dá)的 6648 例可能攜帶 MTB、 耐多藥 MTB 的疑似患者進(jìn)行檢測(cè)， MTB/RIF 也取得類似結(jié)果。,GeneXpert MTB/RIF 系統(tǒng),分子生物學(xué)檢測(cè),GeneXpert MTB

31、/RIF 系統(tǒng)評(píng)價(jià) 極大的改進(jìn)了我們對(duì) TB分子生物學(xué)診斷的看法，該系統(tǒng)高度全自動(dòng)化，生物安全性好，速度快，對(duì)于 TB 的診斷是一大貢獻(xiàn)。但是該系統(tǒng)仍有未克服的缺陷：對(duì)于肺外結(jié)核、痰細(xì)菌培養(yǎng)陰性結(jié)核的檢出率不高，尤其是對(duì)于菌量極少的標(biāo)本；對(duì)于中國(guó)人群來(lái)說(shuō)，利福平耐藥是否真能預(yù)測(cè)大部分異煙肼耐藥尚不能確定；此外，檢測(cè)費(fèi)用高也是限制其推廣的重要原因。,結(jié)語(yǔ),TB 診斷技術(shù)近年來(lái)取得了很大進(jìn)展，將為提高 TB 的診斷水平發(fā)揮重要