TBBPA和TBT對褐鯧鲉(Sebastiscus marmoratus)體內(nèi)C-反應蛋白(CRP)影響的初步探索.pdf

1、本論文以褐菖鲉(Sebastiscus marmoratus)血清CRP作為實驗的研究對象，選擇了兩種目前頗為關注的海洋環(huán)境污染物四溴雙酚A(TBBPA)和三丁基錫(TBT)為污染材料，研究褐菖鲉血清C—反應蛋白(C—reactive Protein)的基本性質(zhì)以及在TBBPA和TBT暴露下的免疫反應特征。實驗分別以0.2mg/L的TBBPA和0.2μg Sn/L的TBT為實驗的暴露濃度，以7個時間梯度(0，3，6，12，24，36，4

2、8h)取樣，通過親和層析純化法、紫外吸收定量法、未變性電泳法(Native—PAGE)、SDS—PAGE電泳法以及酶聯(lián)免疫法(ELISA)等檢測手段，探索了褐菖鲉血清CRP的結構性質(zhì)，系統(tǒng)分析了這種蛋白在環(huán)境污染物TBBPA和TBT脅迫下其含量水平、分子形態(tài)、分子性質(zhì)、表面抗原物質(zhì)所產(chǎn)生的變化，并探討了這些變化的分子內(nèi)部行為機制。結果表明： 1．運用親和層析法提純和紫外吸收定量法得出正常褐菖鲉血清中的CRP含量為378.515

3、±13.51μg/mL；SDS—PAGE和PAS染色法分析發(fā)現(xiàn)該蛋白為糖蛋白，只含有一種亞基，大小約為24.5kDa；表明褐菖鲉和其它絕大部分魚類一樣， CRP中只含有一類為糖蛋白的亞基。 2．TBBPA和TBT暴露處理發(fā)現(xiàn)，褐菖鲉血清CRP的濃度都隨著時間逐漸增高，并且在12h時達到峰值，暴露于TBBPA的CRP最大值為常量的2.079倍，且暴露于TBT的CRP則為常量的2.748倍；隨后，血清CRP的濃度開始下降，到48h

4、時已降到常量水平甚至略低于常量值，這一結果說明了TBBPA和TBT的暴露引起了褐菖鲉CRP含量發(fā)生變化，而變化程度的不同則表明TBT對褐菖鲉可能具有更強的毒性作用。 3．經(jīng)7.5％未變性電泳(Native—PAGE)檢測發(fā)現(xiàn)，未處理的CRPN和經(jīng)過污染物誘導產(chǎn)生的峰值處的CRPs蛋白條帶較為單一，但是各具不同的蛋白質(zhì)遷移率，一方面表明所提取的CRPs純度較純，另一方面可以認為不同污染物的誘導造成相應CRPs分子的分子量、電荷和

5、(或)結構發(fā)生了變化。 4．從TBBPA和TBT暴露下褐菖鲉血清CR2動力學模式上看，CKP經(jīng)兩種污染物誘導，蛋白質(zhì)條帶隨暴露時間經(jīng)由單一→兩條→單一→兩條→單一→單一的變化過程。說明TBBPA和TBT誘導產(chǎn)生了新的CRP形式，而且在暴露于污染物的過程中，CRP以常態(tài)和誘導態(tài)并存。尤其是TBT暴露下CRP誘導態(tài)存在時間更長，該現(xiàn)象進一步證明TBT對褐菖鲉CRP具有更強的誘導性。 5．SDS—PAGE(12％)檢測了C

6、RPN以及經(jīng)TBBPA和TBT誘導的峰值部分的CRPTBBPA和CRPTBT發(fā)現(xiàn)，三種蛋白均有條帶出現(xiàn)在相同的位置，但經(jīng)過污染暴露的誘導態(tài)CRPs在電泳中還出現(xiàn)了其他條帶，說明CRPs中的亞基已經(jīng)產(chǎn)生了不同的變化；以10％SDS—PAGE和15％SDS—PAGE檢測CRPs均得到同樣的結果。Schiff試劑對這三種蛋白染色仍然均呈陽性反應，表明CRP不但在亞分子水平上發(fā)生了變化，而且這些變化可能與其蛋白結構中的碳水化合物的組成有關。

7、 6．通過ELISA法觀察了CRPN與誘導態(tài)CRPTBBPA和CRPTBT的表面抗原性質(zhì)發(fā)現(xiàn)，CRPTBBPA和CRPTBT與兔抗褐菖鲉CRPN血清反應作用強烈，但反應程度有差別。表明褐菖鲉經(jīng)TBBPA和TBT暴露后，盡管三種CRPs均有相似性，但是與抗體結合的親和性卻有明顯的變化，他們結合的順序依次為CRPN＞CRPTBBPA＞CRPTBT。從而進一步說明TBBPA和TBT污染脅迫已經(jīng)引起了CRP表面抗原物質(zhì)的變化，而這些變化可

8、能與褐菖鲉的血清CRP在免疫早期的解毒機制有著密切的關系。 7．將去糖基化的CRPs進行未變性電泳檢測發(fā)現(xiàn)，常態(tài)的CRPN和誘導態(tài)的CRPs遷移位置相同，從而證實了碳水化合物是造成CRP變化的主要原因。 8．CRPs濃度的變化與形態(tài)的轉化有關聯(lián)，在CRPs形態(tài)轉化的過程中，由于常態(tài)CRPs的轉化和機體自身生成誘導態(tài)的CRPs使誘導態(tài)CRPs濃度逐漸升高；另一方面，濃度的升高也可以反應出CRPs形態(tài)的變化。

9、9．CRPs的濃度、形態(tài)以及與抗體親和性的改變與污染物的種類有關，這些參數(shù)的變化情況可以反應污染物毒性的大小。 綜上所述，TBBPA和TBT暴露能在短時間內(nèi)誘導褐菖鲉血清C—反應蛋白(CRP)含量上升，造成相應CRPs分子的分子量、電荷和(或)結構的變化。在TBBPA和TBT暴露過程中，CRP分子存在著動力學的誘導模式，并以常態(tài)和誘導態(tài)并存。其中以TBT的誘導能力為更強。CRP分子性質(zhì)的改變暗示著TBBPA和TBT污染脅迫引起

10、其蛋白結構中碳水化合物組成發(fā)生改變；同時造成CRP表面抗原物質(zhì)的變化。如果能夠獲得針對這些特異性有害物質(zhì)誘導的CRPs抗原決定基的單克隆抗體(Mabs)，就能夠在CRP的微觀異質(zhì)性水平上識別CRP，還可以用來識別有害物質(zhì)。以上結果表明，在污染脅迫下，褐菖鲉機體內(nèi)正常的生理機能受到了影響，CRP作為魚類機體免疫分子中免疫應急機制的調(diào)動，對機體損傷的修復與免疫早期的解毒起了重要的作用。該研究可為我國海洋污染的監(jiān)測和污染早期預警提供理論依據(jù)，