rna的生物合成 3

1、生物化學(xué)與分子生物學(xué),第十六章,RNA的生物合成RNA Biosynthesis ( Transcription ),在生物界，RNA合成有兩種方式,一是DNA指導(dǎo)的RNA合成，也叫轉(zhuǎn)錄，此為生物體內(nèi)的主要合成方式，也是本章介紹的主要內(nèi)容。另一種是RNA指導(dǎo)的RNA合成(RNA-dependent RNA synthesis)，也叫RNA復(fù)制(RNA replication), 由RNA依賴的RNA聚合酶(RNA-dependent

2、 RNA polymerase)催化，常見于病毒，是逆轉(zhuǎn)錄病毒以外的RNA病毒在宿主細(xì)胞以病毒的單鏈RNA為模板合成RNA的方式。,轉(zhuǎn)錄 (transcription) 是生物體以DNA為模板合成RNA的過程 。,轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物除mRNA、rRNA 和tRNA外，在真核細(xì)胞內(nèi)還有snRNA、miRNA等非編碼RNA。,,轉(zhuǎn)錄的知識(shí)是理解許多生物學(xué)現(xiàn)象和醫(yī)學(xué)問題所必需的。對(duì)于RNA生物過程的調(diào)節(jié)可以導(dǎo)致蛋白質(zhì)合成速率的改變，以及由此而引發(fā)的一

3、系列代謝變化， 因此，了解RNA代謝的基本原理就甚為重要。這些原理既關(guān)系到所有生物是如何適應(yīng)環(huán)境變化的，也關(guān)系到細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的分化機(jī)制。,復(fù)制和轉(zhuǎn)錄的區(qū)別,原核生物轉(zhuǎn)錄的模板和酶Templates & Enzymes in prokaryotic transcription,第一節(jié),參與轉(zhuǎn)錄的物質(zhì)：,原料: NTP (ATP, UTP, GTP, CTP) 模板: DNA酶 : RNA聚合酶(RNA polym

4、erase, RNA-pol)其他蛋白質(zhì)因子及Mg2+和Mn2+等,合成方向5?→3?，核苷酸間的連接方式為 3?，5?-磷酸二酯鍵。,一、原核生物轉(zhuǎn)錄的模板,DNA分子上轉(zhuǎn)錄出RNA的區(qū)段，稱為結(jié)構(gòu)基因(structural gene)。轉(zhuǎn)錄的這種選擇性稱為不對(duì)稱轉(zhuǎn)錄(asymmetric transcription)，它有兩方面含義：在DNA分子雙鏈上，一股鏈用作模板指引轉(zhuǎn)錄，另一股鏈不轉(zhuǎn)錄；其二是模板鏈并非總是在同一單鏈上

5、。,5′···GCAGTACATGTC ···3′,3′··· c g t g a t g t a c a g ···5′,,5′···GCAGUACAUGUC ···3′,,N······Ala

6、· Val · His · Val ······C,編碼鏈,模板鏈,mRNA,蛋白質(zhì),轉(zhuǎn)錄,翻譯,DNA雙鏈中按堿基配對(duì)規(guī)律能指引轉(zhuǎn)錄生成RNA的一股單鏈，稱為模板鏈(template strand)，也稱作有意義鏈或Watson鏈。相對(duì)的另一股單鏈?zhǔn)蔷幋a鏈(coding strand)，也稱為反義鏈或Crick鏈。,,,,,5?3?,3?5?

7、,模板鏈,編碼鏈,編碼鏈,,模板鏈,結(jié)構(gòu)基因,不對(duì)稱轉(zhuǎn)錄,二、 RNA聚合酶催化RNA合成,（一）RNA聚合酶能從頭啟動(dòng)RNA鏈的合成,DNA依賴的RNA聚合酶催化合成RNA；RNA合成的化學(xué)機(jī)制與DNA依賴的DNA聚合酶催化DNA合成相似。,( NMP )n + NTP → ( NMP ) n+1 + PPi,RNA,延長(zhǎng)的RNA,DNA依賴的RNA聚合酶催化RNA合成的機(jī)制,,DNA聚合酶在啟動(dòng)DNA鏈延長(zhǎng)時(shí)需要引物存在，而R

8、NA聚合酶不需要引物就能直接啟動(dòng)RNA鏈的延長(zhǎng)。RNA聚合酶和雙鏈DNA結(jié)合時(shí)活性最高，但是只以雙鏈DNA中的一股DNA鏈為模板。 RNA聚合酶和DNA的特殊序列——啟動(dòng)子(promoter)結(jié)合后，就能啟動(dòng)RNA合成。,（二）RNA聚合酶由多個(gè)亞基組成,核心酶 (core enzyme),全酶 (holoenzyme),轉(zhuǎn)錄起始階段,轉(zhuǎn)錄延長(zhǎng)階段,RNA聚合酶全酶在轉(zhuǎn)錄起始區(qū)的結(jié)合,大腸桿菌內(nèi)有一些不同的RNA pol全酶，其

9、差異是σ亞基的不同。目前已發(fā)現(xiàn)多種σ亞基，并用其分子量命名區(qū)別，最常見的是σ70（分子量70 kDa）。σ70是辨認(rèn)典型轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)的蛋白質(zhì)，大腸桿菌中的絕大多數(shù)啟動(dòng)子可被含有σ70因子的全酶所識(shí)別并激活。但有些基因的啟動(dòng)子，如熱激蛋白（heat shock proteins, Hsp）也為另外的σ亞基（σ32 ）識(shí)別。,三、RNA聚合酶結(jié)合到DNA的啟動(dòng)子上啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄,轉(zhuǎn)錄是不連續(xù)、分區(qū)段進(jìn)行的。每一轉(zhuǎn)錄區(qū)段可視為一個(gè)轉(zhuǎn)錄單位，稱為操

10、縱子(operon)。操縱子包括若干個(gè)結(jié)構(gòu)基因及其上游(upstream)的調(diào)控序列。,,調(diào)控序列中的啟動(dòng)子是RNA聚合酶結(jié)合模板DNA的部位，也是控制轉(zhuǎn)錄的關(guān)鍵部位。原核生物以RNA聚合酶全酶結(jié)合到DNA的啟動(dòng)子上而起動(dòng)轉(zhuǎn)錄，其中由σ亞基辨認(rèn)啟動(dòng)子，其他亞基相互配合。 對(duì)啟動(dòng)子的研究，常采用一種巧妙的方法即RNA聚合酶保護(hù)法。,RNA聚合酶保護(hù)法,,開始轉(zhuǎn)錄,,T T G A C AA A C T G T,-35 區(qū),(Pribn

11、ow box),T A T A A T Pu A T A T T A Py,-10 區(qū),,,,RNA-pol辨認(rèn)位點(diǎn)(recognition site),RNA聚合酶保護(hù)法研究轉(zhuǎn)錄起始區(qū),原核生物的轉(zhuǎn)錄過程The Process of Transcription in Prokaryote,第二節(jié),原核生物的轉(zhuǎn)錄過程可分為轉(zhuǎn)錄起始、轉(zhuǎn)錄延長(zhǎng)和轉(zhuǎn)錄終止三個(gè)階段。,RNA聚合酶必須準(zhǔn)確地結(jié)合在轉(zhuǎn)錄模板的起始區(qū)域。DNA雙鏈解開，使其中

12、的一條鏈作為轉(zhuǎn)錄的模板。,一、轉(zhuǎn)錄起始需要RNA聚合酶全酶,轉(zhuǎn)錄起始需解決兩個(gè)問題：,2. DNA雙鏈打開，形成開放轉(zhuǎn)錄復(fù)合體(open transcription complex) ；DNA分子接近-10區(qū)域的部分雙螺旋解開后轉(zhuǎn)錄開始。 DNA雙鏈解開的范圍只在17 bp左右，這比復(fù)制中形成的復(fù)制叉小得多。,1. RNA聚合酶全酶(?2????)識(shí)別并結(jié)合啟動(dòng)子，形成閉合轉(zhuǎn)錄復(fù)合體（closed transcription compl

13、e）；,3. 在RNA聚合酶作用下發(fā)生第一次聚合反應(yīng)，形成第一個(gè)磷酸二酯鍵：,RNApol (?2????) - DNA - pppGpN- OH 3?,轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物:,5?-pppG -OH + NTP ? 5?-pppGpN - OH 3? + ppi,轉(zhuǎn)錄起始過程：,E.coli的轉(zhuǎn)錄起始和延長(zhǎng),,第一個(gè)磷酸二酯鍵生成后，轉(zhuǎn)錄復(fù)合體的構(gòu)象發(fā)生改變， σ亞基即從轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物上脫落，核心酶連同四磷酸二核苷酸，繼續(xù)結(jié)合于DNA

14、模板上，酶沿DNA鏈前移，進(jìn)入延長(zhǎng)階段。,二、 RNA pol核心酶獨(dú)立延長(zhǎng)RNA鏈,1. ?亞基脫落，RNA–pol聚合酶核心酶變構(gòu)，與模板結(jié)合松弛，沿著DNA模板前移；,2. 在核心酶作用下，NTP不斷聚合，RNA鏈不斷延長(zhǎng)。,(NMP) n + NTP ?? (NMP) n+1 + PPi,大腸桿菌的轉(zhuǎn)錄泡局部結(jié)構(gòu)示意,轉(zhuǎn)錄空泡(transcription bubble)：,RNA-pol （核心酶） ·

15、3;·· DNA ···· RNA,轉(zhuǎn)錄延長(zhǎng)以下特點(diǎn),① 核心酶負(fù)責(zé)RNA鏈延長(zhǎng)反應(yīng)；② RNA鏈從5?-端向3? -端延長(zhǎng)，新的核苷酸都是加到3?-OH上；③對(duì)DNA模板鏈的閱讀方向是3?-端向5?-端，合成的RNA鏈與之呈反向互補(bǔ)，即酶是沿著模板鏈的3?向5?方向或沿著編碼鏈的5?向3?方向前進(jìn)的；④ 合成區(qū)域存在著動(dòng)態(tài)變化的8 bp 的RNA-DNA雜合雙鏈；⑤

16、模板DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)隨著核心酶的移動(dòng)發(fā)生解鏈和再?gòu)?fù)合的動(dòng)態(tài)變化。,轉(zhuǎn)錄過程中DNA的超螺旋結(jié)構(gòu)變化,轉(zhuǎn)錄過程中DNA的超螺旋結(jié)構(gòu)變化,三、原核生物轉(zhuǎn)錄延長(zhǎng)與蛋白質(zhì)的翻譯同時(shí)進(jìn)行,在同一DNA模板上，有多個(gè)轉(zhuǎn)錄同時(shí)在進(jìn)行；轉(zhuǎn)錄尚未完成，翻譯已在進(jìn)行。,,,依賴?因子的轉(zhuǎn)錄終止非依賴?因子的轉(zhuǎn)錄終止,四、原核生物轉(zhuǎn)錄終止分為依賴?因子與非依賴?因子兩大類,轉(zhuǎn)錄終止指RNA聚合酶在DNA模板上停頓下來不再前進(jìn)，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物RNA鏈從轉(zhuǎn)錄復(fù)合

17、物上脫落下來。,依據(jù)是否需要蛋白質(zhì)因子的參與，原核生物轉(zhuǎn)錄終止分為：,?因子是由相同亞基組成的六聚體蛋白質(zhì)，亞基分子量46kD。?因子能結(jié)合RNA，又以對(duì)poly C的結(jié)合力最強(qiáng)，但對(duì)poly dC/dG組成的DNA的結(jié)合能力就低得多。 ?因子還有ATP酶活性和解螺旋酶(helicase)的活性。,（一）依賴?因子的轉(zhuǎn)錄終止,?因子：,?因子的作用原理：,（二） 非依賴 ?因子的轉(zhuǎn)錄終止,DNA模板上靠近終止處，有些特殊的堿基序列，

18、轉(zhuǎn)錄出RNA后，RNA產(chǎn)物形成特殊的結(jié)構(gòu)來終止轉(zhuǎn)錄。,,莖環(huán)結(jié)構(gòu)使轉(zhuǎn)錄終止的機(jī)制,使RNA聚合酶變構(gòu)，轉(zhuǎn)錄停頓；局部RNA/DNA雜化短鏈的堿基配對(duì)是最不穩(wěn)定的。RNA鏈上的多聚U也是促使RNA鏈從模板上脫落的重要因素。,,真核生物RNA的生物合成The Biosynthesis of Eukaryote RNA,第三節(jié),,真核生物的轉(zhuǎn)錄過程比原核復(fù)雜。二者的轉(zhuǎn)錄起始過程有較大區(qū)別，轉(zhuǎn)錄終止也不相同。,一、 真核生物有三種DNA依賴

19、的RNA聚合酶,真核生物具有3種不同的RNA聚合酶:,RNA聚合酶Ⅰ（RNA PolⅠ）RNA聚合酶Ⅱ（RNA PolⅡ）RNA聚合酶Ⅲ（RNA Pol Ⅲ）,真核生物的RNA聚合酶,,真核生物RNA聚合酶的結(jié)構(gòu)比原核生物復(fù)雜，所有真核生物的RNA聚合酶都有兩個(gè)不同的大亞基和十幾個(gè)小亞基.RNA polⅡ在核內(nèi)轉(zhuǎn)錄生成核不均一RNA（hnRNA），然后加工成mRNA并輸送給胞質(zhì)的蛋白質(zhì)合成體系。mRNA是各種RNA中壽命最短、最不

20、穩(wěn)定的，需經(jīng)常重新合成。RNA polⅡ還催化合成一些具有重要的基因表達(dá)調(diào)節(jié)作用的非編碼RNA，如長(zhǎng)鏈非編碼RNA（lncRNA）、微RNA（miRNA）和piRNA（與Piwi蛋白相作用的RNA）的合成。,RNA聚合酶Ⅱ由12個(gè)亞基組成，其最大的亞基稱為RBP1。 RNA聚合酶Ⅱ最大亞基的羧基末端有一段共有序列(consensus sequence)為Tyr-Ser-Pro-Thr-Ser-Pro-Ser的重復(fù)序列片段，稱為羧基末

21、端結(jié)構(gòu)域(carboxyl-terminal domain, CTD)。 CTD對(duì)于維持細(xì)胞的活性是必需的。RNA polⅡ是真核生物中最活躍、最重要的酶，故本章敘述的真核生物的轉(zhuǎn)錄主要以RNA polⅡ所催化的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)為例。,二、轉(zhuǎn)錄因子在真核生物轉(zhuǎn)錄起始中具有重要作用,真核生物的基因轉(zhuǎn)錄過程，同樣可以分為3個(gè)階段：起始階段（RNA pol和通用轉(zhuǎn)錄因子形成轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合體）、延長(zhǎng)階段和轉(zhuǎn)錄終止。與原核生物的顯著不同是，起始和延長(zhǎng)

22、過程都需要眾多相關(guān)的蛋白質(zhì)因子參與，這些因子被稱為轉(zhuǎn)錄因子（transcriptional factors, TF）或反式作用因子（trans-acting factors）。,（一）轉(zhuǎn)錄前起始復(fù)合體的形成,不同物種、不同細(xì)胞或不同的基因，轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游都有不同的特異DNA序列，包括啟動(dòng)子、增強(qiáng)子等，統(tǒng)稱為順式作用元件(cis-acting element)。,,,,,,,,,,,,,,轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn),,,,TATA盒,CAAT盒,GC盒,

23、增強(qiáng)子,順式作用元件(cis-acting element),,AATAAA,,,,,,,切離加尾,,轉(zhuǎn)錄終止點(diǎn),,修飾點(diǎn),外顯子,,翻譯起始點(diǎn),,內(nèi)含子,,OCT-1,,,,OCT-1：ATTTGCAT八聚體,,真核生物轉(zhuǎn)錄起始也需要RNA pol對(duì)起始點(diǎn)上游DNA序列進(jìn)行辨認(rèn)和結(jié)合，生成轉(zhuǎn)錄前起始復(fù)合體（preinitiation complex, PIC）。轉(zhuǎn)錄起始時(shí)，真核生物的RNA pol不直接識(shí)別和結(jié)合模板的起始區(qū)，而是依

24、靠轉(zhuǎn)錄因子識(shí)別并結(jié)合起始序列，故其起始復(fù)合體的裝配過程比原核生物復(fù)雜的多。,能直接、間接辨認(rèn)和結(jié)合轉(zhuǎn)錄上游區(qū)段DNA的蛋白質(zhì)，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)數(shù)百種，統(tǒng)稱為反式作用因子(trans-acting factors)。 反式作用因子中，直接或間接結(jié)合RNA聚合酶的，則稱為通用轉(zhuǎn)錄因子（general transcription factor）或基本轉(zhuǎn)錄因子（basal transcription factor）,,真核生物中不同的RNA pol需

25、要不同的基本轉(zhuǎn)錄因子（TF）配合完成轉(zhuǎn)錄的起始和延長(zhǎng)。相對(duì)應(yīng)于RNA pol I、 RNA pol II、RNA pol III，這些TF分別稱為TFI、TFII、TFIII。,參與RNA-polⅡ轉(zhuǎn)錄的TFⅡ的作用,真核RNA聚合酶Ⅱ與通用轉(zhuǎn)錄因子的作用過程,閉合轉(zhuǎn)錄復(fù)合體的形成步驟,① 由TFIID中的TBP識(shí)別TATA盒，并在TAFs的協(xié)助下結(jié)合到啟動(dòng)子區(qū)，然后TFIIB與TBP結(jié)合，同時(shí)TFIIB也能與DNA結(jié)合，TFIIA可以

26、穩(wěn)定與DNA結(jié)合的TFIIB-TBP復(fù)合體；② TFIIB-TBP復(fù)合體與RNA pol II-TFIIF復(fù)合體結(jié)合，此舉可降低RNA pol II 與DNA的非特異部位的結(jié)合，協(xié)助RNA pol II 靶向結(jié)合啟動(dòng)子；③ TFIIE和TFIIH加入，形成閉合復(fù)合體，裝配完成。,TFIIH具有解旋酶（helicase）活性，能使轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)附近的DNA雙螺旋解開，使閉合轉(zhuǎn)錄復(fù)合體成為開放轉(zhuǎn)錄復(fù)合體，啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄。TFIIH還具有激酶活性，

27、它的一個(gè)亞基能使RNA pol II的CTD磷酸化。CTD磷酸化能使開放復(fù)合體的構(gòu)象發(fā)生改變，啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄。CTD磷酸化在轉(zhuǎn)錄延長(zhǎng)期也很重要，而且影響轉(zhuǎn)錄后加工過程中轉(zhuǎn)錄復(fù)合體和參與加工的酶之間的相互作用。當(dāng)合成一段含有60～70個(gè)核苷酸的RNA時(shí)，TFIIE和TFIIH釋放，RNA pol II進(jìn)入轉(zhuǎn)錄延長(zhǎng)期。此后，大多數(shù)的TF就會(huì)脫離轉(zhuǎn)錄前起始復(fù)合物。,除了基本轉(zhuǎn)錄因子外，真核基因的轉(zhuǎn)錄起始還有其他轉(zhuǎn)錄因子的參與，如與啟動(dòng)子上游元件

28、如GC盒、CAAT盒等順式作用元件結(jié)合的上游因子（upstream factor），與遠(yuǎn)隔調(diào)控序列如增強(qiáng)子等結(jié)合的反式作用因子，以及在某些特殊生理或病理情況下被誘導(dǎo)產(chǎn)生的可誘導(dǎo)因子（inducible factor）的參與。,（二）少數(shù)幾個(gè)反式作用因子的搭配啟動(dòng)特定基因的轉(zhuǎn)錄,為了保證轉(zhuǎn)錄的準(zhǔn)確性，不同基因需不同轉(zhuǎn)錄因子。拼板理論(piecing theory) ：少數(shù)幾個(gè)反式作用因子（主要是可誘導(dǎo)因子和上游因子）之間互相作用，再與基

29、本轉(zhuǎn)錄因子、RNA聚合酶搭配而有針對(duì)性地結(jié)合、轉(zhuǎn)錄相應(yīng)的基因?？烧T導(dǎo)因子和上游因子常常通過輔激活因子或中介子與基本轉(zhuǎn)錄因子、RNA聚合酶結(jié)合，但有時(shí)也可直接與基本轉(zhuǎn)錄因子、RNA聚合酶結(jié)合。,三 、真核生物轉(zhuǎn)錄延長(zhǎng)過程中沒有轉(zhuǎn)錄與翻譯同步的現(xiàn)象,真核生物轉(zhuǎn)錄延長(zhǎng)過程與原核生物大致相似，但因有核膜相隔，沒有轉(zhuǎn)錄與翻譯同步的現(xiàn)象。 RNA-pol前移處處都遇上核小體。轉(zhuǎn)錄延長(zhǎng)過程中可以觀察到核小體移位和解聚現(xiàn)象。,,RNA-Pol,,R

30、NA-Pol,,RNA-Pol,核小體,轉(zhuǎn)錄延長(zhǎng)中的核小體移位,,,,,轉(zhuǎn)錄方向,四、真核生物的轉(zhuǎn)錄終止和加尾修飾同時(shí)進(jìn)行,真核生物的轉(zhuǎn)錄終止，是和轉(zhuǎn)錄后修飾密切相關(guān)的。真核生物mRNA有聚腺苷酸(poly A)尾巴結(jié)構(gòu)，是轉(zhuǎn)錄后才加進(jìn)去的。轉(zhuǎn)錄不是在poly A的位置上終止，而是超出數(shù)百個(gè)乃至上千個(gè)核苷酸后才停頓。已發(fā)現(xiàn)，在讀碼框架的下游，常有一組共同序列AATAAA，再下游還有相當(dāng)多的GT序列。這些序列稱為轉(zhuǎn)錄終止的修飾點(diǎn)。,5

31、?------AAUAAA-,,5? ------AAUAAA--,核酸酶,,-GUGUGUG,RNA-pol,,AATAAA GTGTGTG,轉(zhuǎn)錄終止的修飾點(diǎn),,,5?,5?,3?,3?,,,3?加尾,AAAAAAA······ 3? mRNA,,轉(zhuǎn)錄終止,—— 和轉(zhuǎn)錄后修飾密切相關(guān)。,真核生物的轉(zhuǎn)錄終止及加尾修飾,真核生物RNA的加工和降解 The

32、Processing and Degradation of Eukaryotic RNA,第四節(jié),,真核生物轉(zhuǎn)錄生成的RNA分子是初級(jí)RNA轉(zhuǎn)錄物(primary RNA transcript)，幾乎所有的初級(jí)RNA轉(zhuǎn)錄物都要經(jīng)過加工，才能成為具有功能的成熟的RNA。加工主要在細(xì)胞核中進(jìn)行。,幾種主要的修飾方式：,1. 剪接(splicing),2. 剪切(cleavage),3. 修飾(modification),4. 添加(add

33、ition),5. RNA編輯(RNA editing),一、核不均一RNA經(jīng)首、尾修飾和剪接后成為mRNA,真核生物mRNA轉(zhuǎn)錄后，需要進(jìn)行5?-端和3?-端（首、尾部）的修飾以及對(duì)hnRNA進(jìn)行剪接（splicing），才能成為成熟的mRNA，被轉(zhuǎn)運(yùn)到核糖體，指導(dǎo)蛋白質(zhì)翻譯。,（一）前體mRNA在5?-末端加入“帽”結(jié)構(gòu),大多數(shù)真核mRNA的5?-末端有7-甲基鳥嘌呤的帽結(jié)構(gòu)。這個(gè)真核mRNA加工過程的起始步驟由兩種酶，加帽酶(c

34、apping enzyme)和甲基轉(zhuǎn)移酶(methyltransferase)催化完成。,帽結(jié)構(gòu),帽結(jié)構(gòu)的生成過程,帽結(jié)構(gòu)的意義：,可以使mRNA免遭核酸酶的攻擊；也能與帽結(jié)合蛋白質(zhì)復(fù)合體(cap-binding complex of protein)結(jié)合，并參與mRNA和核糖體的結(jié)合，啟動(dòng)蛋白質(zhì)的生物合成。,（二）前體mRNA在3?-端特異位點(diǎn)斷裂并加上多聚腺苷酸尾,尾部修飾是和轉(zhuǎn)錄終止同時(shí)進(jìn)行的過程。poly A的有無與長(zhǎng)短，

35、是維持mRNA作為翻譯模板的活性，以及增加mRNA本身穩(wěn)定性的因素。一般真核生物在胞漿內(nèi)出現(xiàn)的mRNA，其poly A長(zhǎng)度為100至200個(gè)核苷酸之間，也有少數(shù)例外。前體mRNA分子的斷裂和加多聚腺苷酸尾是多步驟過程。,,AAUAAA,,G/U,5’,3’,Poly(A)信號(hào),Poly(A)位點(diǎn),,mRNA,,,CPSF,,G/U,5’,3’,CPSF,,,CFI,CFII,CStF,,CPSF,CStF,,,CFI,CFII,,,

36、PAP,,CPSF,CStF,,,CFI,CFII,PAP,ATP,（二）前體mRNA在3?-端特異位點(diǎn)斷裂并加上多聚腺苷酸尾,1. hnRNA 和 snRNA,核內(nèi)的初級(jí)mRNA稱為雜化核RNA (hetero-nuclear RNA, hnRNA)snRNA (small nuclear RNA),（三）前體mRNA的剪接主要是去除內(nèi)含子,,在細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)的初級(jí)轉(zhuǎn)錄物的分子量往往比在胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)的成熟mRNA大幾倍，甚至數(shù)十倍。核

37、酸序列分析證明，mRNA來自hnRNA，而hnRNA和DNA模板鏈可以完全配對(duì),去除初級(jí)轉(zhuǎn)錄物上的內(nèi)含子，把外顯子連接為成熟RNA的過程稱為mRNA剪接（mRNA splicing）。,真核生物結(jié)構(gòu)基因，由若干個(gè)編碼區(qū)和非編碼區(qū)互相間隔開但又連續(xù)鑲嵌而成，去除非編碼區(qū)再連接后，可翻譯出由連續(xù)氨基酸組成的完整蛋白質(zhì)，這些基因稱為斷裂基因。,斷裂基因(splite gene),編碼區(qū) A、B、C、D,外顯子(exon)和內(nèi)含子(intron

38、),外顯子：在斷裂基因及其初級(jí)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物上出現(xiàn)，并表達(dá)為成熟RNA的核酸序列。內(nèi)含子：隔斷基因的線性表達(dá)而在剪接過程中被除去的核酸序列。,雞卵清蛋白成熟mRNA與DNA雜交電鏡圖,,DNA,,mRNA,雞卵清蛋白基因,hnRNA,首、尾修飾,hnRNA剪接,成熟的mRNA,雞卵清蛋白基因及其轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后修飾,1. 內(nèi)含子形成套索RNA被剪除,剪接首先涉及套索RNA（lariat RNA）的形成，即內(nèi)含子區(qū)段彎曲，使相鄰的兩個(gè)外顯子互相

39、靠近而利于剪接。此后，還發(fā)現(xiàn)內(nèi)含子近3′端的嘌呤甲基化，例如3mG是形成套索所必需的。,1. 內(nèi)含子在剪接接口處剪除,大多數(shù)內(nèi)含子都以GU為5?端的起始，而其末端則為AG-OH-3?。5?GU……AG-OH-3?稱為剪接接口（splicing junction）或邊界序列。剪接后，GU或AG不一定被剪除。,3. 剪接過程需兩次轉(zhuǎn)酯反應(yīng),,4. 剪接體是內(nèi)含子剪接場(chǎng)所,,,5. 前體mRNA分子有剪切和剪接兩種模式,前體mRNA

40、分子的加工除上述剪接外，還有一種剪切（cleavage）模式。剪切指的是剪去某些內(nèi)含子后，在上游的外顯子3?-端直接進(jìn)行多聚腺苷酸化，不進(jìn)行相鄰?fù)怙@子之間的連接反應(yīng)。剪接是指剪切后又將相鄰的外顯子片段連接起來，然后進(jìn)行多聚腺苷酸化。,6. 前體mRNA分子可發(fā)生可變剪接,許多前體mRNA分子經(jīng)過加工只產(chǎn)生一種成熟的mRNA，翻譯成相應(yīng)的一種多肽；有些則可剪切或（和）剪接加工成結(jié)構(gòu)有所不同的mRNA，這一現(xiàn)象稱為可變剪接（altern

41、ative splicing），又稱選擇性剪接。,,真核細(xì)胞基因的前體mRNA交替加工的兩種機(jī)制,,大鼠降鈣素基因轉(zhuǎn)錄本的可變剪接,有些基因的蛋白質(zhì)產(chǎn)物的氨基酸序列與基因的初級(jí)轉(zhuǎn)錄物序列并不完全對(duì)應(yīng)，mRNA上的一些序列在轉(zhuǎn)錄后發(fā)生了改變，稱為RNA編輯（RNA editing）。 RNA編輯作用說明，基因的編碼序列經(jīng)過轉(zhuǎn)錄后加工，是可有多用途分化的，因此也稱為分化加工(differential RNA processing)。,（四

42、）mRNA編輯是對(duì)基因的編碼序列進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后加工,,APOB基因的mRNA在肝和腸黏膜編碼不同多肽鏈,二、真核rRNA前體經(jīng)過剪接形成不同類別的rRNA,真核前體rRNA轉(zhuǎn)錄后的剪切,三、真核生物前體tRNA的加工包括核苷酸的堿基修飾,tRNA前體,,tRNA核苷酸轉(zhuǎn)移酶、連接酶,ATP,ADP,,堿基修飾,四、RNA催化一些真核和原核基因內(nèi)含子的自剪接,1982年美國(guó)科學(xué)家T. Cech和他的同事發(fā)現(xiàn)四膜蟲（tetrahymena th

43、ermophilic）編碼rRNA前體的DNA序列含有間隔內(nèi)含子序列，并且在沒有任何來自四膜蟲的蛋白質(zhì)情況下，rRNA前體能準(zhǔn)確地剪接去除內(nèi)含子。這種由RNA分子催化自身內(nèi)含子剪接的反應(yīng)稱為自剪接（self-splicing）。,一些噬菌體的mRNA前體及細(xì)菌tRNA前體也發(fā)現(xiàn)有這類自身剪接的內(nèi)含子，并被稱之為I型內(nèi)含子（group I intron）。I型內(nèi)含子以游離的鳥嘌呤核苷或鳥嘌呤核苷酸作為輔因子完成剪接。鳥嘌呤核苷或鳥嘌呤核苷

44、酸的3′-OH與內(nèi)含子的5′-磷酸共同參與轉(zhuǎn)酯反應(yīng)。這種轉(zhuǎn)酯反應(yīng)與前述的mRNA內(nèi)含子剪接的轉(zhuǎn)酯反應(yīng)類似，不過參與反應(yīng)的不是分支點(diǎn)A的2?-OH，切除的內(nèi)含子是線狀，而不是“套索”狀。某些線粒體和葉綠體的mRNA前體和tRNA前體還有另一類自身剪接的內(nèi)含子，稱為II型內(nèi)含子。這類內(nèi)含子的剪接與前面介紹的前體mRNA內(nèi)含子剪接相同，但是沒有剪接體參與,,I和II型內(nèi)含子的剪切,五、RNA在細(xì)胞內(nèi)的降解有多種途徑,正常轉(zhuǎn)錄物和異常轉(zhuǎn)錄物的

45、降解途徑有一定差異。前者包括依賴于脫腺苷酸化的mRNA降解和不依賴于脫腺苷酸化的mRNA 降解；后者包括無義介導(dǎo)的mRNA 降解、無終止降解、無停滯降解和核糖體延伸介導(dǎo)的降解等。但細(xì)胞內(nèi)少部分正常mRNA也可經(jīng)由無義介導(dǎo)的途徑降解。,（一）依賴于脫腺苷酸化的mRNA降解是重要的mRNA代謝途徑,,mRNA的5?-端帽和3?-端的poly (A)尾結(jié)構(gòu)對(duì)于mRNA的穩(wěn)定性具有重要作用。當(dāng)細(xì)胞以mRNA為模板進(jìn)行蛋白質(zhì)合成時(shí)，翻譯起始

46、因子 eIF4E、eIF4G和3? poly(A)結(jié)合的PABP等相互作用而形成封閉的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，防止來自脫腺苷酸化酶（deadenylase）和脫帽酶（decapping enzyme）的攻擊，以保證mRNA的穩(wěn)定。因此，mRNA的降解必須首先解除這些穩(wěn)定因素，脫腺苷酸化及帽結(jié)構(gòu)的水解是其中的重要步驟，故稱為依賴于脫腺苷酸化的mRNA降解。,依賴于脫腺苷酸化的mRNA降解,（二）無義介導(dǎo)的mRNA降解是重要的真核細(xì)胞mRNA質(zhì)量監(jiān)控機(jī)