利用定點(diǎn)突變分析白念珠菌依賴鐵基因frp1啟動子元件

1、生物工程學(xué)報ChinJBiotech2008August2524(8):13481353journals.im.ChineseJournalofBiotechnologyISSN10003061cjb@im.?2008InstituteofMicrobiologyCASAccepted:February272008Supptedby:theNationalNaturalScienceFoundationofChina(No.305700

2、96)thePh.DProgramsFoundationofMinistryofEducationofChina(No.20070055011)theScientificResearchFoundationfReturnedScholarsMinistryofEducationofChina.Crespondingauth:MingchunLi.Tel:862223508506Fax:862223508800Email:lmchun68

3、@.cn國家自然科學(xué)基金(No.30570096)教育部博士點(diǎn)基金資助項(xiàng)目(No.20070055011)教育部留學(xué)回國人員科研啟動基金(教外司留(2005)546號)資助。研究報告利用定點(diǎn)突變分析白念珠菌依賴鐵基因FRP1啟動子元件桂磊梁勇魏東盛鄭雯邢來君李明春南開大學(xué)微生物學(xué)系分子微生物學(xué)與技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室天津300071摘要:通過對白念珠菌高鐵還原酶基因FRP1啟動子進(jìn)行突變分析確認(rèn)啟動子中特殊調(diào)控元件。我們通過分析FRP1起

4、始密碼子上游1000bp序列發(fā)現(xiàn)在?160和?650處有2個推測的Rim101p結(jié)合位點(diǎn)對其分別進(jìn)行定點(diǎn)突變?nèi)缓髽?gòu)建啟動子與報告基因LacZ融合質(zhì)粒轉(zhuǎn)化整合到白念珠菌rim101株和野生株中檢測不同缺鐵條件下?半乳糖苷酶活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)堿性條件Rim101p能夠正向調(diào)控FRP1的表達(dá)啟動子?160處突變對啟動子功能影響較弱而?650突變使啟動子活性大大降低此結(jié)果和雙突變的結(jié)果相同表明Rim101p主要通過與啟動子?650處結(jié)合位點(diǎn)相互作用

5、來調(diào)控FRP1的表達(dá)。關(guān)鍵詞:定點(diǎn)突變白念珠菌Rim101蛋白高鐵還原酶基因RegulatingPromoterElementofIrondependentGeneFRP1inCidaalbicansbySitedirectedMutationLeiGuiYongLiangDongshengWeiWenZhengLaijunXingMingchunLiKeyLabatyofMolecularMicrobiologyTechnologyM

6、inistryofEducationDepartmentofMicrobiologyNankaiUniversityTianjin300071ChinaAbstract:Microarrayanalysisrevealedthattheexpressionofferricreductase(FRP1)canberegulatedbytheRim101protein.Indertofindnewtranionalregulatyeleme

7、ntinthepromoterofFRP1weanalyzedthe1000bpsequenceupstreamofATGtofind2potentialRim101pbindingsites.WegeneratedsitespecificmutationsineachofthetwositesfusedthesemutatedpromoterstoLacZ.ThenthepromoterLacZfusionconstructwasre

8、combinantintowildtyperim101strainsf?galactosidaseassay.TheresultsrevealedthattheFRP1wasupregulatedinalkalinepHthiswascausedbyironstarvation.The?650sitenotthe?160sitehadanimptantroleinFRP1Rim101pdependentexpression.Weconc

9、ludethatRim101pmayinteractwiththe?650bindingsiteofthepromotertoregulatetheFRP1expression.Keywds:sitedirectedmutationCidaalbicansRim101proteinferricreductasegene鐵是生物必需的重要營養(yǎng)元素鐵離子是許多生化途徑例如呼吸作用三羧酸循環(huán)DNA和氨基酸的合成等過程中酶的輔助因子在自然界中生

10、物體可直接吸收利用的鐵非常有限因此微生物在長期的進(jìn)化過程中形成高親和的鐵吸收系統(tǒng)來滿足細(xì)胞鐵離子需要。真菌中高親和吸收系統(tǒng)在釀酒1350ISSN10003061CN111998QChinJBiotechAugust252008Vol.24No.8Journals.im.變位點(diǎn)的引物E160mut和E160反mut以FRP1啟動子為模板分別用P1、E160mut和P2、E160反mutpfu酶PCR獲得帶有突變的兩端片段DNA回收試劑盒回

11、收純化后以這2條片段(比例1:1)為模板P1和P2為引物PCR獲得1條1000bp的DNA條帶即為突變完成的啟動子PFRP1160mut。PFRP1650mut和PFRP1160650mut突變方法同上。1.6?半乳糖苷酶活性的測定將轉(zhuǎn)化子接種于35mLTC199培養(yǎng)基中30oC振蕩培養(yǎng)至OD600≈1.0時收集菌體?半乳糖苷酶活性的測定見文獻(xiàn)[9]?半乳糖苷酶的活性計算公式OD400(顏色)1000[OD600(菌濃)t(min)3(