白念珠菌新基因MRF1的耐藥相關(guān)功能研究.pdf

1、白念珠菌疾病易于感染、難以防治的特點(diǎn)使其在臨床治療中表現(xiàn)為強(qiáng)烈的致病性和高耐藥性。前期研究顯示白念珠菌耐藥性形成過(guò)程中可能伴隨著線粒體氧化呼吸功能的改變，并發(fā)現(xiàn)與線粒體呼吸相關(guān)的基因MRF1在耐藥株中表達(dá)上調(diào)。為了確證白念珠菌耐藥形成的“呼吸體抑制”假說(shuō)，進(jìn)一步闡明白念珠菌的耐藥形成機(jī)制。 本課題采用Ura—Blaster基因敲除策略靶向敲除和pCaEXP質(zhì)粒異位表達(dá)線粒體呼吸功能相關(guān)的基因MRF1，構(gòu)建了MRF1基因缺失菌和高

2、表達(dá)菌。將構(gòu)建好的菌株通過(guò)比濁法測(cè)定生長(zhǎng)曲線；通過(guò)spotassay和微量液基實(shí)驗(yàn)來(lái)考察MRF1缺失菌對(duì)唑類(lèi)藥物的敏感性及過(guò)氧化氫的刺激耐受性是否改變；通過(guò)熒光染料檢測(cè)MRF1基因缺失菌的線粒體膜電位、ATP產(chǎn)生和內(nèi)源性活性氧水平(ROS)，通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR考察了MRF1基因高表達(dá)后，其他已知耐藥相關(guān)基因表達(dá)量的變化；又考察了MRF1缺失菌生物被膜、菌絲的形成能力、細(xì)胞膜甾醇成份和外排能力的改變情況，較全面的研究了MRF1基因的相關(guān)功

3、能。 結(jié)論：成功構(gòu)建白念珠菌MRF1基因缺失菌和基因高表達(dá)菌；MRF1基因缺失后：菌株線粒體膜電位、ATP含量略降低，菌株生長(zhǎng)速度延緩、對(duì)氧化刺激敏感性略增加、ROS產(chǎn)生略增多。釀酒酵母中MRF1編碼的Ybr026p為2—烯酰硫酯還原酶，它催化線粒體脂肪酸合成通路Ⅱ的最后一步反應(yīng)，產(chǎn)生作為線粒體膜成份之一的脂肪酸及合成硫辛酸的前體。由于白念MRF1p與Ybr026p同源，因此我們推測(cè)上述結(jié)果是因?yàn)镸RF1缺失后不能正常合成2—烯

4、酰硫酯還原酶，造成線粒體膜一定程度上的破損，細(xì)胞色素內(nèi)容物降低，進(jìn)而減弱呼吸作用而導(dǎo)致的。但我們通過(guò)測(cè)定基因缺失菌的藥物MIC80值和spotassay實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)其對(duì)唑類(lèi)藥物的耐藥性并沒(méi)有顯著性的改變，也不影響細(xì)胞膜的甾醇含量和外排能力，這一現(xiàn)象在Real-Time結(jié)果中也得以證實(shí)。由于線粒體膜的功能維持涉及了大量的編碼因子，推測(cè)MRF1基因非其決定性因素，所以其缺失不能對(duì)白念線粒體呼吸產(chǎn)生明顯的抑制作用。此外，本研究發(fā)現(xiàn)白念珠菌MRF